РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 1, с. 100-107
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
УДК 612.42:599:539.1.047
ИЗМЕНЕНИЯ В СТРУКТУРЕ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ КРЫС, ПОДВЕРГНУТЫХ ВНЕШНЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ у-ИЗЛУЧЕНИЯ С НИЗКОЙ МОЩНОСТЬЮ ДОЗЫ
© 2007 г. Л. А. Климкина*, В. И. Федорченко, Л. К. Бездробная
Институт ядерных исследований Национальной Академии Наук Украины, Киев, Украина
Исследовано действие у-излучения с мощностью дозы 0.72 сГр/сут на плазматические мембраны целых лимфоцитов периферической крови крыс, облученных в дозах 1.5, 15, 30, 60 и 100 сГр. Изучали параметры, характеризующие вязкость и полярность липидного бислоя, а также свойства внешней поверхности мембраны с помощью флюоресцентных зондов пирена и 1-анилинонафталин-8-суль-фоната (АНС). Обнаружены изменения (которые не носили монотонного характера по мере увеличения дозы) структурных характеристик мембраны по сравнению с контролем после облучения животных в дозах 1.5, 15, 60 и 100 сГр. После облучения в дозах ниже 30 сГр изменения спектральных характеристик проявлялись не в каждом отдельном опыте, что, вероятно, обусловлено индивидуальными особенностями развития радиационного ответа. При облучении в дозах выше 30 сГр изменения носили воспроизводимый характер. После облучения в дозе 1.5 сГр наблюдались небольшое уменьшение полярности липидного бислоя и разнонаправленные изменения параметров связывания АНС, а после облучения в дозах 15, 60 и 100 сГр - увеличение полярности и перераспределение полярных групп внутри бислоя, повышение вязкости более полярных доменов мембраны и понижение флюоресценции АНС в основном за счет снижения квантового выхода. После облучения в дозе 60 сГр наряду с увеличением вязкости более полярных доменов наблюдалось уменьшение вязкости гидрофобных участков, а после облучения в дозе 100 сГр и существенное изменение заряда поверхности. Выявленные изменения указывают на перестройки внешней поверхности мембраны и интенсификацию окислительных процессов в липидном бислое.
у-излучение, малые мощности доз, плазматические мембраны, флюоресцентные зонды, лимфоциты.
В механизмах развития эффектов облучения в малых дозах большая роль отводится повреждению клеточных мембран [1, 2]. С одной стороны, компоненты биологических мембран являются субстратом для индуцированных радиацией окислительных процессов, с другой - участвуют в формировании исходного антиоксидантного статуса, который во многом определяет конечный эффект низкоинтенсивного облучения [3, 4]. Кроме того, существует тесная взаимосвязь между структурными изменениями, происходящими под действием радиации, в мембранах и ДНК [5, 6]. Изменение конформационного состояния мембран может быть одним из возможных механизмов переключения клеток на другой уровень функционирования [5].
Известно, что выполнение специфичных функций лимфоцитами крови определяется во многом именно функционированием их мембран. Излучение в малых дозах может как стимулировать, так и угнетать функциональную активность этих клеток [7], что может быть связано непо-
*Адресат для корреспонденции: Украина, 03680 Киев, Проспект Науки, 47, ИЯИ НАНУ; тел.: +38 (044) 525-49-20; факс: +38 (044) 525-44-63; e-mail: klimkina@kinr.kiev.ua.
средственно с изменениями в структуре клеточных мембран. Существуют лишь единичные публикации, посвященные исследованию состояния мембран лимфоцитов крови под действием низкоинтенсивного излучения [8, 9].
Исходя из изложенного, целью данной работы было изучение зависимости от дозы низкоинтенсивного внешнего воздействия у-излучения ряда физико-химических параметров, характеризующих состояние липидного бислоя и внешней поверхности мембран лимфоцитов крови крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Исследование проводили на нелинейных крысах-самцах 3-месячного возраста с начальной массой 190-210 г. Крыс подвергали воздействию у-излучения 60Со на установке "Эталон" с мощностью дозы 0.72 сГр/сут в дозах 1.5, 15, 30, 60 и 100 сГр в течение 2, 21, 42, 84 и 139 сут соответственно. Облучение прерывали только для ухода за животными на 30 мин один раз в сутки. Животных содержали на стандартном пищевом рационе в условиях 12-часового цикла дня и ночи. Контрольных животных содержали в аналогичных
условиях в отсутствии источника облучения. На каждую дозу облучения эксперименты поставлены не менее, чем в трех повторностях.
Взятие крови проводили сразу после прекращения облучения (в утренние часы) из бедренной вены при легкой наркотизации животных. В качестве антикоагулянта использовали гепарин из расчета 25 ед. на 1 мл крови. Лимфоциты выделяли в градиенте плотности фиколл-верографина (р = 1.077) по методике [10]. В каждом эксперименте клетки, изолированные из крови не менее, чем пяти облученных и/или контрольных животных, объединяли в одну пробу. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.
Определяли параметры связывания флюоресцентных зондов пирена ("Merck", ФРГ) и 1-анили-нонафталин-8-сульфоната (АНС) ("Serva", ФРГ) с мембранами целых лимфоцитов. Измерения проводили на флюоресцентном спектрофотометре модели "Hitachi 850" (Япония) в термостатиру-емых кюветах при температуре 37°С в среде Хенкса.
Спектры флюоресценции пирена в мембранах лимфоцитов регистрировали при длине волны возбуждения Хв = 337 нм и ширине щелей моно-хроматоров со стороны возбуждения и эмиссии 5 и 2 нм соответственно. Концентрация пирена в суспензии лимфоцитов составляла 1-5 мкмоль/л, концентрация клеток - 107 кл/мл. Соответствие процесса самотушения флюоресценции мономеров уравнению Штерна-Фольмера проверяли по методу [11]. Поскольку во всех проведенных нами экспериментах тушение флюоресценции мономерной формы пирена его эксимерами по мере увеличения концентрации пирена в мембранах соответствовало уравнению Штерна - Фольмера, можно считать, что весь пирен находился в ли-пидной фазе. Вязкость мембран оценивали как величину обратно пропорциональную коэффициенту эксимеризации пирена (Kex), который, согласно [12], определяли по отношению интенсивности флюоресценции мономеров при длине волны испускания (эмиссии) ^эм = 373 нм к интенсивности флюоресценции эксимеров при ^эм = 470 нм и концентрации пирена в среде инкубации. Полярность мембран оценивали как величину обратно пропорциональную отношению 3-го и 1-го виб-ронных пиков тонкой структуры спектра пирена (///1) [12]. Наклон профиля полярности мембраны определяли согласно работе [13].
Для определения параметров связывания АНС с поверхностью мембраны проводили титрование лимфоцитов зондом и зонда лимфоцитами по методике [11]. Определяли интенсивность флюоресценции при максимальной концентрации зонда в суспензии (IAHC), константу связывания АНС (КАНС), количество центров связывания (Л^АНС), квантовый выход флюоресценции, т.е. отноше-
ние количества излучаемых квантов к количеству квантов, поглощаемых зондом за единицу времени (бАНс). Флюоресценцию АНС регистрировали при ширине щелей монохроматоров со стороны возбуждения и эмиссии 5 нм, длинах волн возбуждения флюоресценции = 385 нм и эмиссии ^эм = 490 нм. Концентрация АНС в суспензии лимфоцитов составляла 5-80 мкмоль/л при титровании зондом и 20 мкмоль/л при титровании лимфоцитами, концентрация клеток - 5 х 106 и 106-107 кл/мл соответственно. Зависимость флюоресценции АНС от концентрации зонда и концентрации лимфоцитов в суспензии выражали в двойных обратных координатах. При линейной аппроксимации экспериментальных данных полученная зависимость имеет вид: для титрования зондом
11
F
1
KahcNahc[M]Fmol [ AHC] Nahc[M]Fmol'
1
для титрования мембранами
1 =_1__и_
Р Канс^АНС [ АНС ] ^то1 [М] [ АНС ]
где Р - интенсивность флюоресценции зонда, [АНС] - концентрация зонда, [М] - концентрации лимфоцитов в суспензии, Рто1 - величина молярной флюоресценции, зависящая от параметров установки и QAHC. Параллельно по методике [14] оценивали произведение Л^АНС и QАНС (параметр NQ).
Изменение заряда поверхности мембраны определяли по методике [11] согласно формуле:
kT K
Фо- Фк = —In
ahc
K АНС
где ф0, K АНС и фК, K АНС - заряд внешней поверхности мембраны и КАНС лимфоцитов облученных и контрольных животных соответственно, k - постоянная Больцмана, T - абсолютная температура, z - заряд зонда (для АНС равен 1), e - заряд электрона.
Результаты обрабатывали статистически с использованием ¿-критерия Стьюдента [15], линейную аппроксимацию данных проводили с помощью Microsoft® Excel 97.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что при инкубации биологических мембран с гидрофобным зондом пиреном его молекулы встраиваются во все участки углеводородной области бислоя [16] и с увеличением концентрации зонда занимают все более полярные области мембраны [17]. Таким образом, изменение параметра f/f с ростом концентрации зонда характеризует градиент полярности в исследуемой
Кех, отн.ед. Мь отн.ед.
Концентрация пирена, мкмоль/л
Рис. 1. Зависимость вязкости (1) и полярности (2) микроокружения пирена в мембранах лимфоцитов интактных крыс от концентрации пирена. Результат типичного эксперимента.
структуре [13]. На рис. 1 представлены зависимости параметров, характеризующих полярность и вязкость мембран лимфоцитов крови интактных крыс, от концентрации пирена в суспензии клеток. Видно, что по мере возрастания полярности также изменяется вязкость микроокружения зонда, образуя профиль вязкости мембраны. Сопоставление профилей вязкости и полярности показывает, что вязкость тем ниже, чем меньше полярность
данной области мембраны, т.е. уменьшается по направлению от более гидрофобных участков, которые преимущественно находятся в середине бислоя, ближе к поверхности мембраны. Этот факт согласуется с данными, полученными при изучении градиента вязкости мембран лимфоцитов методом оценки вращательного движения зондов в мембране [18]. При изменении состояния клетки под влиянием каких-либо факторов может наблюдаться изменение градиента вязкости либо в целом, либо на отдельных его участках, учитывая гетерогенность клеточных мембран.
На рис. 2 представлены результаты конкретных экспериментов по изучению полярности мембран лимфоцитов после
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.