ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 707-714
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:581.331.2
ИЗМЕНЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО рН ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН Petunia hybrida ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭКЗОГЕННЫХ ФИТОГОРМОНОВ
© 2007 г. И. М. Андреев, Г. В. Тимофеева, Ю. В. Минкина, Л. В. Ковалева
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 12.10.2006 г.
Исследовано влияние экзогенных синтетических гормонов ИУК, АБК и ГК3 на внутриклеточный рН (рНс) непрорастающих и прорастающих пыльцевых зерен петунии (Petunia hybrida L.). Для оценки рНс использовали флуоресцеин диацетат. У непрорастающих пыльцевых зерен рНс относительно быстро снижался под действием всех выбранных соединений, а затем через 10-15 мин постепенно возвращался к своему исходному значению. Прорастающие пыльцевые зерна в присутствии ИУК и АБК претерпевали относительно быстрое защелачивание цитозоля, которое в испытанном временном интервале практически не обращалось со временем. Вместе с тем, ГК3 вызывал закис-ление цитозоля, т.е. эффект, подобный тому, что наблюдался в непрорастающих пыльцевых зернах. Гормон-индуцированный щелочной сдвиг рНс прорастающих пыльцевых зерен полностью подавлялся в присутствии ортованадата натрия, тогда как в отсутствие гормонов этот ингибитор не влиял на величину рНс. Ортованадат натрия также заметно замедлял кинетику восстановления рНс непрорастающих пыльцевых зерен после гормон-индуцированного закисления цитозоля, приводил к снижению рНс тех же пыльцевых зерен в контроле и сильно ослаблял в них эффекты всех испытанных гормональных препаратов. На основании этих результатов предполагается, что физиологическое действие фитогормонов в данной системе включает в себя модуляцию рНс, а именно временное нарушение гомеостатической регуляции рН цитозоля клеток пыльцевого зерна, которое может играть сигнальную роль в инициации дальнейших клеточных ответных реакций, запускаемых фи-тогормонами. Полученные данные позволяют заключить, что гормон-индуцированный щелочной сдвиг рНс пыльцевых зерен опосредован активностью Н+-АТФазы их плазматической мембраны и что действие этого протонного насоса включается в регуляцию рНс клеток как прорастающих, так и непрорастающих пыльцевых зерен.
Petunia hybrida - пыльцевые зерна - фитогормоны - внутриклеточный рН - флуоресцеин диацетат -рН-гомеостаз - Н+-АТФаза
ВВЕДЕНИЕ
В репродуктивном процессе у растений ключевую роль играет прогамная фаза оплодотворения, которая состоит в доставке спермиев к семяпочке и включает в себя каскад событий, запускающих прорастание пыльцы на поверхности рыльца и рост пыльцевых трубок в тканях пестика и завязи [1, 2]. К настоящему времени достигнут заметный прогресс в выяснении молекулярных механизмов восприятия и проведения соответствующих сигналов в системе пыльца-пестик [3, 4]. Результаты, полученные в ходе таких исследований, демонстрируют важную роль транс-
Сокращения: рНс - внутриклеточный (цитоплазматиче-ский) рН; BCECF-AM - ацетоксиметиловый эфир 2',7'-6ис-(2-карбоксиэтил)-5(6')-карбоксифлуоресцеина. Адрес для корреспонденции: Ковалева Лидия Валентиновна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: kovaleva_l@mail.ru
порта основных физиологически важных ионов через плазмалемму клеток пыльцевого зерна в регуляции прорастания мужского гаметофита [5, 6]. Кроме того, они дают основание полагать, что механизмы трансдукции сигналов в такой системе могут базироваться на транзиторных сдвигах тех или иных параметров ионного гомеостаза клеток пыльцевого зерна, таких как, например, внутриклеточный рН или рСа.
Давно известно, что пыльцевые зерна содержат большую часть классических фитогормонов [7, 8] и, как недавно установлено, их прорастание в условиях in vitro сопровождается изменением эндогенного уровня таких соединений и чувствительно к действию экзогенных гормонов [9, 10]. Эти данные могут свидетельствовать об участии этих соединений в процессе прорастания пыльцевого зерна. Однако вопросы, касающиеся механизма их действия и возможности их функционирования как сигнальных молекул в системе пыльца-пестик, остаются пока открытыми.
707
5*
Сообщения, имеющиеся в литературе в настоящее время, показывают, что выявление роли фитогормонов и/или потребности в них в тех или иных процессах в растениях может основываться на использовании в исследованиях такого рода двух основных методических подходов. В одном из них исследования проводятся на мутантных растительных объектах, дефектных в биосинтезе того или иного фитогормона [11], в то время как основу другого, более традиционного подхода составляет изучение действия экзогенных соединений данного типа [12].
В настоящей работе исследовано влияние ряда экзогенных синтетических гормонов на рН цито-золя пыльцевых зерен петунии, гидратированных в соответствующей буферной среде и находящихся как в состоянии покоя, так и на стадии прорастания. Цель работы заключалась в выяснении вопроса о том, способны ли экзогенные гормональные препараты вызывать временное нарушение ионного гомеостаза пыльцевых зерен, а именно гомеостатической регуляции их цитоплазматиче-ского рН. При этом мы исходили из того, что гор-мон-индуцированный сдвиг внутриклеточного рН в принципе может быть вовлечен в каскад событий, обуславливающих трансдукцию гормональных сигналов в системе пыльца-пестик как in vivo, так и in vitro [9, 10].
МЕТОДИКА
Эксперименты проводили на свежесобранной пыльце растений петунии (Petunia hybrida L.), выращенных в оранжерее Института физиологии растений РАН в условиях почвенной культуры и при естественном освещении.
Внутриклеточный рН (рНс) пыльцевых зерен оценивали после их предварительной нагрузки флуоресцеин диацетатом ("Serva", Германия) или ацетоксиметиловым эфиром 2',7'-бмс(2-карбок-сиэтил)-5(6')-карбоксифлуоресцеина (BCECF-AM) ("Sigma", США). Как липид-растворимые эфиры эти соединения способны проникать через плазматическую мембрану внутрь клеток и превращаться в цитозоле в результате отщепления от них ацетильных групп под действием цитозоль-ной эстеразы соответственно во флуоресцеин и BCECF. Как заряженные гидрофильные флуоро-форы они остаются в цитозоле и характеризуются выраженной рН-зависимостью спектров возбуждения и флуоресценции [13, 14]. На основании измерений интенсивностей флуоресценции образцов при 530 нм, возбуждаемой при 440 (F440) и 490 (F490) нм, рассчитывали величину отношения F490/F440 как меру рНс [14]. До начала измерений свежесобранные пыльцевые зерна инкубировали при 25°С в течение 1 ч в буферной среде, содержавшей 0.3 М сахарозу и 25 мМ Mes-Трис (рН 6.9). После этого пыльцевые зерна помещали на 15 мин в
среду загрузки, содержавшую 0.3 М сахарозу и 25 мМ Mes-Трис (рН 6.9), с добавлением 5 мкМ рН-индикатора, отмывали от красителя и помещали в 1 мл буферной среды того же состава, но без индикатора. Процесс прорастания пыльцевых зерен инициировали при 26°С, помещая их на 1 ч в водную среду, содержавшую 0.4 М сахарозу и 1.6 мМ H3BO3. Для построения калибровочной кривой in situ, используемой для расчета рНс, пыльцевые зерна инкубировали в течение 15 мин в средах того же состава, но различающихся величиной рНо (рНо изменялся от 5.5 до 7.5) и содержавших 5 мМ ацетата аммония в качестве агента, снимающего трансмембранный рН-градиент [15]. После этого измеряли флуоресценцию образцов, как указано выше. Те же среды, но не содержавшие ацетата аммония, были использованы для предварительной калибровки рН-индикатора (2 мкМ) in vitro. Измерения проводили на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi 850 (Япония) в стандартных 1-сантиметровых кюветах без постоянного перемешивания суспензии пыльцевых зерен.
Все описанные ниже результаты работы, полученные с использованием флуоресцеин диаце-тата, были подтверждены в экспериментах того же типа, в которых индикатором рНс служил BCECF-AM.
На рисунках приведены среднеарифметические значения измеряемого параметра и их стандартные ошибки, рассчитанные на основании данных, полученных в 4-5 независимых экспериментах. О достоверности наблюдаемых различий средних значений измеряемого параметра судили по /-критерию Стьюдента при 5%-ном уровне значимости (p < 0. 05).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В проведенных нами экспериментах было установлено, что рНс непрорастающих пыльцевых зерен петунии только в слабой степени зависит от рН инкубационной среды и, подобно цито-зольному рН большинства эукариотических клеток, находится в области нейтральных значений рН (6.7-7.0) (рис. 1). Как выяснилось, пыльцевые зерна петунии, находящиеся на стадии прорастания, характеризуются несколько более низкой величиной рНс (6.0).
Добавление ряда классических фитогормонов, таких как ИУК, АБК и ГК3 (до конечной концентрации 10 мкМ), к суспензии пыльцевых зерен в буферной среде инициировало относительно быстрое и значительное по величине снижение их рНс (рис. 2). Можно видеть, однако, что наблюдаемое изменение рНс после достижения своего максимального значения постепенно исчезало. Восстановление рНс, вторая, более медленная фаза гормон-индуцируемого сдвига рНс, происхо-
дило в течение 10-15 мин после добавления гормона к среде. Вместе с тем, в пыльцевых зернах, обработанных ИУК или ГК3, рНс в конце этого промежутка времени становился даже более высоким по сравнению с контролем.
Поскольку характер действия фитогормонов может зависеть от физиологического состояния клеток пыльцевого зерна, представляло интерес выяснить, изменяется ли и каким образом их рНс под влиянием таких соединений, когда они добавлены к пыльцевым зернам, находящимся на стадии прорастания. Согласно нашим микроскопическим наблюдениям, такие зерна уже прошли стадию активации и начали прорастать. Как следует из результатов, представленных на рис. 3, значительный сдвиг в величине рНс наблюдался нами и в этих условиях. Однако, в отличие от рассмотренного выше гормон-индуцированного смещения рНс, наблюдаемый здесь эффект носил качественно иной характер в случае ИУК и АБК. Он выражался в относительно быстром защела-чивании цитозоля пыльцевых клеток, кото
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.