БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1058-1065
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.353.22
ИЗОФОРМНЫЙ СОСТАВ ТАЙТИНА В МЫШЦАХ ПРИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ
© 2008 г. И.М. Вихлянцев*, З.А. Подлубная* **
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области;
**Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области
E-mail: vikhlyantsev@iteb.ru Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Проведено электрофоретическое исследование изменений изоформного состава тайтина в скелетных и сердечных мышцах человека и крысы при патологических процессах. Обнаружено более значительное снижение количества интактных изоформ тайтина, чем N2BA- и К2Б-форм тайтина в гипертрофированном сердце у спонтанно гипертензивных крыс, N2A-фоpмы тайтина в спинной мышце человека с «синдромом ригидного человека» и в mus^lus soleus человека и крыс при развитии «гипогравитационного мышечного синдрома». В последнем случае выявлена зависимость между снижением содержания тайтина и увеличением времени пребывания крыс в условиях моделируемой микрогравитации. На электрофореграммах миокарди-альной ткани левого желудочка сердца пациентов с конечной стадией дилатационной кар-диомиопатии интактный тайтин отсутствовал. При этом отсутствовала и N2BA-фоpма тайтина, а также наблюдалось значительное снижение количества N2B-фоpмы тайтина, что, вероятно, является следствием терминальной стадии болезни. Полученные результаты показывают, что развитие заболевания сопровождается более значительным разрушением интактного тайтина, чем других его форм, что может быть важным для диагностики развития патологического процесса.
Ключевые слова: интактные изоформы тайтина, N2B-, N2BA-, Ы2А-формы тайтина, фрагменты тайтина, дилатационная кардиомиопатия, «синдром ригидного человека», гипертрофия сердца, «гипогравитационный мышечный синдром».
Тайтин (коннектин) - гигантский эластичный белок, формирующий третий тип нитей в саркомерах поперечно-полосатых мышц позвоночных [1]. Он является важным полифункциональным белком, вовлеченным в регуляцию многих процессов в саркомере в норме (для ссылок см. [2]). Развитие патологии сопровождается изменениями структуры и функций тай-тина, чему посвящено большое количество работ, выполненных за последние годы [2]. Эти исследования включают в себя и электрофоретическое тестирование изменений тайтина в мышцах при патологии. В частности, выявлены количественные изменения К2БЛ- и К2Б-форм тайтина в сердечной мышце человека [3,4] и собаки [5] при развитии дилатационной кар-диомиопатии (ДКМП), ишемическом поражении сердца человека [6], а также в гипертрофированном сердце крысы [7]. Значительные деструктивные изменения тайтина обнаружены в сердце человека на терминальной стадии
Сокращения: ДКМП - дилатационная кардимиопатия, ТЦМ - тяжелые цепи миозина.
ДКМП [8,9], а также в m. soleus человека и крыс после пребывания в условиях моделируемой микрогравитации [10-12]. Однако все эти исследования не учитывали изменений при патологии высокомолекулярных форм тайтина, которые по нашим электрофоретическим и иммунологическим данным [13] могут являться интактными изоформами этого белка. В этой работе представлены новые электрофоретиче-ские и иммунологические подтверждения в пользу нашего предположения, а также впервые проведено сравнительное изучение изменений интактного тайтина и его N2A-, N2B- и N2BA-форм в сердечных и скелетных мышцах человека и животных при патологических процессах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Были использованы образцы предсердий и левого желудочка гипертрофированного сердца спонтанно гипертензивных крыс и образцы гравитационно-зависимой m. soleus крыс Wistar Kyoto после моделирования условий микрогравитации (3-, 7-, 14- и 30-суточное вывешивание
крыс по методу, описанному в работе [14]). Спонтанно гипертензивные крысы были получены и содержались в питомнике корпуса Биомедицинских исследований Филиала ИБХ РАН (Пущино). Крысы Wistar Kyoto содержались в виварии ГНЦ РФ ИМБП РАН (Москва). Протокол работы с животными был утвержден комиссией по биоэтике. В качестве контроля использовали образцы скелетных и сердечных мышц животных в норме: крыс Wistar Kyoto, кроликов породы Шиншилла и летних активных сусликов Spermophillus undulatus.
Были исследованы биопсийные образцы m. soleus человека, взятые до и после экспериментов по моделированию условий микрогравитации (семисуточная «сухая иммерсия» по методу, описанному в работе [15]). Эксперименты по моделированию гравитационной разгрузки у крыс и человека были проведены в ГНЦ РФ ИМБП РАН (Москва). Проведение исследований на человеке было одобрено физиологической секцией Российской национальной комиссии по биологической этике. В работе также были исследованы биопсийные образцы миокарда левого желудочка сердца от четырех пациентов с конечной стадией дилатационной кардиомиопатии и биопсии мышцы, выпрямляющей позвоночник, от трех пациентов с «синдромом ригидного человека». Клинический материал был предоставлен Институтом экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росздрава (Москва) и клиникой нервных болезней им. А.Я. Кожевникова Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-электрофорез) проводили по модифицированной нами методике [16] в вертикальных ага-розных гелях с содержанием полиакриламида 1,9 - 2,3 %. Методика приготовления гелей заключалась в следующем: к раствору, содержащему определенное количество акриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36,5:1), ДСН, трис-HCl буфера, рН 8,8-9,0 и нагретому до температуры 40°С, добавляли расплавленную агарозу до концентрации 0,55 %. Конечная концентрация акриламида составляла 1,9 - 2,3 %, ДСН - 0,1 %, трис-НС1 буфера -0,5 М. Полимеризацию инициировали добавлением 0,058 % тетраметилэтилендиамина и 0,075 % персульфата аммония и осуществляли в течение двух-трех часов при комнатной температуре. Для солюбилизации белков перед проведением гель-электрофореза образцы скелетных мышц инкубировали в растворе, содержащем 10 мМ трис-НС1, 1,5 % ДСН, 10 %
глицерина, 2 % Р-меркаптоэтанола (или 75 мМ дитиотреитола (ДТТ)), 8-10 мкг/мл ингибитора протеаз леупептина (или Е-64), рН 6,8 -7,0.
Электродный буфер содержал: глицина -0,192 М, трис - 0,025 М, ДСН - 0,1 %, рН 8,3. Электрофорез проводили в гелях размером 8x10 см (мини-гели) и 14,5x16 см при силе тока 10 - 12 и 25 - 30 мА соответственно. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 10 % этанола и 10 % уксусной кислоты в течение 20 - 30 мин. Затем гели окрашивали в течение 30 - 40 мин в растворе, содержащем по 0,05 % кумасси G-250 и R-250, 45 % этанола и 10 % уксусной кислоты. Отмывание окрашенных гелей проводили в 7 % уксусной кислоте. Денситометрическую обработку гелей проводили с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11. В качестве стандартов для оценки молекулярных масс были использованы полосы тяжелых цепей миозина (ТЦМ) (205 кДа), небулина (770 - 890 кДа), тайтина-2 (2100 - 2400 кДа) [17-20]. Количество тайтина оценивали по отношению к количеству тяжелых цепей миозина. В табл. 1 и 2 приведены средние арифметические величины соотношений интегральных плотностей соответствующих белковых полос на гелях и их стандартные ошибки. Статистическую обработку проводили с использованием í-критерия Стьюдента.
Иммуноблоттинг тайтина проводили по методу, описанному в работе [13]. В качестве первичных антител использовали: AB5 (к участку молекулы тайтина в А-диске, расположенному около М-линии саркомера), BD6 (к участку молекулы тайтина, расположенному на границе А-диска и I-области саркомера), Z1/Z2 (к N-концу молекулы тайтина, расположенному в Z-диске саркомера). В качестве вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, использовали антитела против IgG мышей (Sigma) или кролика («Имтек», Москва). Белковые полосы выявляли с помощью 3,3'-диа-минобензидина.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Тестирование интактных изоформ тайтина. На рис. 1 и 2 представлены результаты электрофоретического и иммунологического тестирования тайтина в скелетных и сердечных мышцах исследуемых животных. Наряду с известными формами тайтина (Т2-фрагментами, N2B, N2BA, N2A) в геле присутствуют более высокомолекулярные формы тайтина, что подтверждается данными иммуноблоттинга (рис. 2), а также результатами окраски гелей эти-
Рис. 1. Интактные изоформы тайтина в поперечно-полосатых мышцах суслика: 1 - левый желудочек сердца; 2 - m. soleus. Указаны белковые полосы: тяжелых цепей миозина (ТЦМ); небулина - цитоскелетного белка тонких нитей; Т2-, N2B-, N2BA- и N2A-фpагментов тайтина; интактных N2B-, N2BA- и N2A-изофоpм тайтина. Электрофорез проведен в вертикальном геле размером 14,5 х 16 см с содержанием агарозы 0,55 % и полиакриламида 1,9 %. На врезках: (а) - увеличенный фрагмент электрофореграммы с интактными N2B- и N2BA-изофоpмами тайтина в левом желудочке сердца суслика. По данным денситометрии отношение количества интактной N2BA-изофоpмы тайтина к количеству интактной N2B-изофоpмы составило ~0,326; отношение количества N2BA-фpагмента тайтина к количеству N2B-фpагмента составило ~0,320; (б) - логарифмическая зависимость молекулярной массы от электрофоретической подвижности белков в геле.
дийбромидом, не выявившими агрегации этих форм тайтина с нуклеиновыми кислотами (данные не показаны). Молекулярные массы высокомолекулярных форм тайтина составили ~ 3300 - 3400 кДа в сердечной мышце и ~3400 - 3700
кДа в скелетных мышцах (рис. 1), тогда как молекулярные массы К2Б-, К2БЛ- и К2Л-форм тайтина составили ~2400 - 2900 кДа.
Рис. 2. Иммуноблоттинг тайтина в поперечно-полосатых мышцах животных: 1,4 - т. soleus суслика; 2,3 левый желудочек сердца суслика; 5 - левый желудочек сердца кролика.
Ранее с помощью метода иммуноэлектрон-ной микроскопии было показано, что молекулы тайтина располагаются в саркомере, заякоре-ваясь С-концом в М-линии и К-концом в 2-диске [21,22]. В результате проведенных позднее исследований по секвенированию гена тайтина был
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.