ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 579-583
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ИЗОФОРМЫ ПЕРОКСИДАЗ И КОДИРУЮЩИЕ ИХ РНК В ЛИСТЬЯХ ПОДСОЛНЕЧНИКА ПОСЛЕ ЗАРАЖЕНИЯ Alternaría helianthi
© 2007 г. Г. Анджана, К. Р. Кайни, X. С. Шетти, X. С. Пракаш
Отделение прикладной ботаники и биотехнологии, Майсурский университет, Майсур, Индия
Поступила в редакцию 03.11.2006 г.
Альтернариоз, или темно-бурая пятнистость листьев, вызываемый грибом Alternarla helianthi, является одним из важнейших биотических факторов, снижающих урожайность культуры подсолнечника. Биохимические основы устойчивости подсолнечника к этому заболеванию еще мало изучены. Известно, что возникновению устойчивости предшествует запуск реакций раннего ответа, в том числе активация пероксидаз. В данной работе, выполненной с использованием нативного ПААГ-электрофореза и нозерн-блот-анализа, показана активная роль пероксидаз в реакции устойчивости/восприимчивости подсолнечника (Helianthus annuus L.) к возбудителю альтернариоза. После инфицирования листьев устойчивого и восприимчивого генотипов подсолнечника наблюдали различающуюся во времени индукцию нескольких изоформ пероксидазы. В листьях устойчивого генотипа экспрессия трех изоформ пероксидазы, П01, П02 и ПО3, была обнаружена через 2 и 12 ч после заражения. В листьях восприимчивого генотипа изоформа П02 присутствовала спустя 24 и 48 ч после инкубации с патогеном, в то время как изоформа ПОЗ обнаруживалась только спустя 24 ч. В ходе всего эксперимента восприимчивый генотип характеризовался более низким по сравнению с устойчивым генотипом, уровнем экспрессии пероксидазы. Результаты нозерн-блот-анализа с использованием гетерологичных кДНК зондов свидетельствуют о резком усилении экспрессии пероксидазы в листьях устойчивого генотипа спустя 2 и 12 ч после инфицирования. Полученные данные позволяют говорить об участии изоформ пероксидазы в формировании устойчивости подсолнечника к A. helianthi и о важной роли в этом процессе генетической регуляции, проявляющейся в различном накоплении транскриптов.
Helianthus annuus - Alternaria helianthi - пероксидаза - изоформы - транскрипты - устойчивость
ВВЕДЕНИЕ
Потери урожая подсолнечника при поражении грибом Alternaria helianthi, вызывающим альтернариоз, или темно-бурую пятнистость листьев, составляют до 80%, что наносит огромный ущерб фермерским хозяйствам [1]. Отсутствие четких представлений о биохимической природе ранних защитных реакций растений при инфицировании A. helianthi затрудняет идентификацию маркеров устойчивости и снижает эффективность традиционных стратегий в борьбе с альтернариозом [2]. Наличие индуцибельной системы защиты позволяет растениям противостоять воздействию патогенов. Устойчивость растения к патогену определяется способностью быстро распознать его и запустить защитные реакции [3]. Проникновение патогена приводит к активации ряда сигнальных
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; PR-белки -белки, связанные с патогенезом (от Pathogenesis-Related proteins); П01, П02, ПО3 - изоформы пероксидазы. Адрес для корреспонденции: H.S. Prakash. Department of Studies in Applied Botany and Biotechnology, University of Mysore, Mysore-570 006 Karnataka, India. E-mail: hsp@appbot.uni-mysore.ac.in
соединений, белков, связанных с патогенезом (PR-бeлкoв) и антиоксидантных ферментов растения-хозяина [4].
Известно, что важную роль в развитии устойчивости к патогенезу играет синтез и накопление PR-бeлкoв. Пероксидаза (ПО) относится к классу 9 PR-бeлкoв растений и характеризуется широким спектром действия и разнообразием кодирующих генов [5]. При инфицировании патогеном этот фермент катализирует реакцию конденсации фенолов с образованием лигнина, обладающего антимикробными свойствами. Пероксидаза также участвует в детоксикации активных форм кислорода (АФК), образующихся в ходе физиологического стресса, вызванного патогенезом [6]. ПО растений существуют в нескольких изофор-мах, которые участвуют в различных процессах, начиная с реакции гиперчувствительности, лиг-нификации, превращения фенолов, гликопротеи-нов и опробковения до синтеза фитоалексинов [7]. В литературе появляется все больше доказательств того, что патоген играет ведущую роль в осуществлении временной и пространственной регуляции экспрессии пероксидаз, способствующей формированию системной приобретенной
579
7*
устойчивости [8-9]. В данной работе предпринята попытка идентифицировать различные по времени индукции изоформы пероксидазы и изучить накопление их транскриптов в подсолнечнике после инфицирования грибом A. helianthi.
МЕТОДИКА
В работе использовали растения подсолнечника Helianthus annuus L. двух генотипов: устойчивого MSH-59 и восприимчивого Morden. Растения выращивали в оранжерее в глиняных горшках диаметром 12 см, заполненных почвой, песком и перегноем в соотношении 2 : 1 : 1 при 25-30°С и относительной влажности воздуха более 95%. Растения в возрасте 4 нед. инокулировали суспензией конидий Alternaría helianthi (Hansf.) в концентрации 106 конидий/мл [10]. Контрольные растения обрабатывали стерильной дистиллированной водой. Листья отделяли сразу после инокуляции или спустя 2, 4, 8, 12, 24 и 48 ч после инокуляции и хранили при -20°С. Для каждого опыта использовали навеску листьев 1 г, которую экстрагировали 1 мл 100 м М калий-фосфатного буфера (рН 7.0) и затем центрифугировали 15 мин при 4°С при 10000 об./мин. Супернатант отделяли и использовали для дальнейших исследований. Экстракты, содержавшие 20 мкг белка, разделяли нативным электрофорезом в вертикальном 8%-ном полиа-криламидном геле [11] с последующим окрашиванием бензидином и перекисью водорода [12]. Содержание белка определяли по методике, описанной в работе [13], с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве стандарта. Определения проводили в трех по-вторностях.
Для анализа накопления транскриптов использовали навески листьев в 1 г. Листья отделяли сразу после инокуляции патогеном или спустя 2, 3, 9, 12, 24, 48 и 72 ч после инокуляции и хранили при -80°C. Листья растирали в жидком азоте и общую РНК экстрагировали методом, описанным в работе [14], с использованием фенола и хлороформа с последующим осаждением LiCl2. Экстракты РНК (20 мкг) разделяли в 1.2%-ном (вес/объем) агарозном геле с добавлением формальдегида. Бромистый этидий вносили вместе с пробами РНК, чтобы контролировать количество внесенной РНК [15]. После разделения РНК переносили на нейлоновую мембрану Hybond ("Amersham", Великобритания) по описанной методике [15] и проводили гибридизацию с меченными радиоактивным фосфором кДНК зондами к пероксидазе ячменя (pBH63-01, № X58396) ("KVL", Дания). Гибридные комплексы РНК-ДНК экспонировали с IP-пластинами и результаты визуализировали с помощью системы Multifunctional Image Analysis System FLA 5000 ("Fuji", Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В листьях растений подсолнечника устойчивого и восприимчивого генотипов после заражения патогеном наблюдали дифференциальную индукцию нескольких изоформ пероксидазы (рис. 1). В образцах обоих генотипов только изоформа П01 присутствовала постоянно в ходе всего эксперимента. В ходе анализа были выявлены значительные временные различия в числе изоформ и сроках их экспрессии. Кроме конститутивной изоформы П01 при электрофорезе были выявлены изоформы П02 и П03, однако их экспрессия значительно различалась. Так, экспрессия П01 была интенсивнее в образцах устойчивого генотипа вне зависимости от времени, прошедшего после инфицирования. В листьях восприимчивого генотипа наблюдали низкий уровень экспрессии П01 в течение всего эксперимента, кроме 12 и 48 ч после инокуляции. Изоформы П02 и П03 были обнаружены в листьях устойчивого генотипа уже через 2 ч после инфицирования. Уровень их экспрессии снижался к 4 и 8 ч, но вновь повышался спустя 12 ч после инокуляции. В листьях восприимчивого генотипа высокий уровень экспрессии изоформ П02 и П03 наблюдали через 24 ч после инокуляции. Через 48 ч изоформа П03 в листьях восприимчивого генотипа исчезала, в то время как накопление П02 достигало максимального уровня.
Число транскриптов в листьях обоих генотипов после инфицирования значительно увеличивалось. Сразу после инокуляции, а также спустя 2 и 12 ч число транскриптов П0 было больше в листьях устойчивого генотипа. Через 72 ч после инокуляции число транскриптов П0 в листьях устойчивого генотипа снижалось. У восприимчивого генотипа число транскриптов П0 стабильно увеличивалось с 3 до 72 ч после инокуляции, однако уровень экспрессии оставался более низким, чем в листьях устойчивого генотипа (рис. 2). Активация пероксидаз является показателем раннего ответа растения на воздействие патогена [16]. В данной работе изучали активацию экспрессии П0 и ее связь с восприимчивостью подсолнечника к А. helianthi. Известно, что изменение активности П0 после инфицирования патогеном, как правило, сопровождается изменением изофер-ментного состава [17]. Результаты, полученные в данной работе, свидетельствуют о том, что изоформы пероксидазы конститутивно присутствуют в листьях как устойчивого, так и восприимчивого генотипов подсолнечника. Это указывает на то, что пероксидазы в растении выполняют множество функций и участвуют в ряде физиологических процессов, включая реакцию гиперчувствительности, лигнификацию, превращения фенолов и гликопротеинов, опробковение и синтез фитоалексинов [7]. Показано, что повышение
ИЗОФОРМЫ ПЕРОКСИДАЗ И КОДИРУЮЩИЕ ИХ РНК 0 2 4 8 12 24 48 0 2 4 8 12 24 48
-ПО1
-ПО2 -ПО3
ПО1
Устойчивый генотип после инфицирования
0 2 4 8 12 24 48
Устойчивый генотип, контроль
0 2 4 8 12 24 48
ПО1
ПО2 ПО3
ПО1
Восприимчивый генотип после инфицирования
Восприимчивый генотип, контроль
Рис. 1. Дифференциальная индукция изоформ пероксидазы в листьях подсолнечника.
Цифры верхней шкалы обозначают часы после инокуляции патогеном. Представлены типичные результаты одного из трех опытов.
уровня экспрессии изоформ ПО в растениях хлопчатника коррелирует с повышением их устойчивости к патогену Verticillium dahliae, поэтому выявленные изоформы фермента применялись в дальнейшем в к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.