НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 2, с. 143-149
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.858:615.214
ИЗУЧЕНИЕ АУТО- И ГЕТЕРОРЕЦЕПТОРНЫХ ПУТЕЙ МОДУЛЯЦИИ ПРЕСИНАПТИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА ДОФАМИНА В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ НОВОГО ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ГИМАНТАНА in vitro
© 2007 г. Г. И. Ковалев*, Д. А. Абаимов, М. В. Воронин, Ю. Ю. Фирстова, О. В. Долотов
ГУ НИИ фармакологии им. ВВ. Закусова РАМН, Москва
В опытах in vitro изучали влияние гимаитаиа, оригинального производного 2-аминоадамантана с противопаркинсонической активностью, на обратный захват дофамина (ДА) синаптосомами стри-атума крыс, а также на связывание с D1-, D2-, D3- и NMDA-рецепторами ДА и глутамата соответственно методом радиолигандного связывания. Обнаружено, что ни гимантан, ни препарат сравнения мидантан (амантадин) в диапазоне концентраций от 10-11 до 10-3 М не влияют на связывание [G-3H]-SCH23390 и ^-3Н]-спиперона с D1- и D2-рецепторами, соответственно, но в концентрациях >10 мкМ подавляют взаимодействие 7-OH-[G-3H]-DPAT с DS-рецепторами ДА. Причем величина IC50 у первого (39 мкМ) почти на порядок ниже таковой у мидантана (360 мкМ). В отношении NMDA-рецеп-торов оба препарата обнаружили однородный характер влияния: величины констант полуингиби-рования IC50 соответствовали 5.5 мкМ у гимантана и 4.0 мкМ у мидантана. Показано, что гимантан достоверно ингибировал обратный захват [3Н]-дофамина в концентрациях 100-500 мкМ. При изучении кинетики ингибирования захвата величина Vmax c 9.0 пмоль/мин/мг белка в контроле уменьшалась до 5.1 пмоль/мин/мг белка (p < 0.05), тогда как величина Km оставалась неизменной (0.5 мкМ), что характерно для неконкурентного типа ингибирования. Антагонисты NMDA-рецеп-торов (±)CPP и MK-801 подавляли обратный захват [3Н]-ДА с IC50 6 и 38 мкМ соответственно. NM-DA (1, 10, 100 мкМ) не влиял, а квискваловая кислота ингибировала транспорт дофамина на 37% при 100 мкМ (p < 0.05). Видимо, механизм увеличения эффективности дофаминергической передачи при действии производных адамантана может включать неконкурентное ингибирование транспорта дофамина.
Ключевые слова: дофамин, синаптосомы, обратный захват, NMDA-рецепторы, rnNMDA-рецеп-торы, паркинсонизм, противопаркинсонические препараты, производные адамантана.
ВВЕДЕНИЕ
Болезнь Паркинсона является одним из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний ЦНС: по данным ВОЗ (отчет ВОЗ, 1997) ежегодно паркинсонизмом заболевают около 65 тыс. человек. Считается, что болезнь Паркинсона вызывается дефицитом дофаминергической передачи в стриатуме, который, в свою очередь, обуславливается дегенерацией нейронов компактной части черной субстанции [1, 2].
Широкой распространенностью паркинсонизма обусловлен повышенный интерес к различным препаратам, обладающим дофаминопози-тивными и нейропротекторными свойствами. Так, распространение в клинике получил 1-амино-адамантана гидрохлорид - мидантан (Amantadine, Symmetrel), противопаркинсоническое действие которого обнаружено в 1968 г. [3, 4]. Предполагается, что клинический эффект производных адаман-
* Адресат для корреспонденции: 125315 Москва, ул. Балтийская, д. 8; тел.: 601-2051; факс: 151-1261; e-mail: g.kova-lev@relcom.ru
тана обусловлен их способностью воздействовать на несколько нейрохимических систем одновременно и наличием у них ярко выраженных нейро-протективных свойств [5]. Установлено, что в условиях in vitro мидантан связывается с глута-матными (NMDA типа) и ацетилхолиновыми рецепторами с величинами IC50 и Ki в пределах 0.01— 0.10 мкМ [3]. В числе значимых функциональных нейрохимических эффектов мидантана отмечено влияние на высвобождение ацетилхолина, норад-реналина, дофамина (ДА), а также на захват серо-тонина и ДА препаратами стриатума [3].
В Институте фармакологии РАМН был синтезирован и фармакологически изучен новый потенциальный противопаркинсонический препарат гимантан ^-адамант-2-ил гексаметиленимина гидрохлорид, А-7), не уступающий мидантану по противопаркинсонической эффективности (рис. 1) [6]. Нейрохимически ДА-позитивное действие гимантана было подтверждено в экспериментах in vivo (увеличение уровня внеклеточного ДА в микродиализатах стриатума) [7] и in vitro (ингибирование МАО-В). Предположено, что эти эф-
A
NH2
HCl
Рис. 1. Химическая структура мидантана и гимантана. Наиболее важная общая черта - симметричная каркасная структура адамантана. Принципиальное отличие гимантана от мидантана - наличие гексаметиле-ниминового кольца во втором положении, которое обусловливает более высокие фармакокинетические характеристики гимантана.
A. 1-Аминоадамантана гидрохлорид. Мидантан (Amantadine). Противопаркинсоническое и противогриппозное средство.
Б. N-2-Адамантил-гексаметиленимина гидрохлорид. Гимантан (Hemantane). Потенциальное противопаркинсоническое средство.
фекты могут быть связаны с неконкурентной блокадой гимантаном канала NMDA-рецептора по типу "trapping block" [8]. Однако более полное понимание механизма действия препарата ограничено отсутствием данных о прямом влиянии препарата на собственно рецепторы ДА и глута-мата, а также на другие звенья пресинаптической локализации - обратный захват и биосинтез ДА.
В данном исследовании было изучено in vitro действие гимантана на: а) D1-, D2- и DS-рецепто-ры ДА; б) NMDA-рецепторы глутамата; в) синап-тосомальный захват ДА препаратами стриатума крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. Исследования проводили на самцах крыс линии Wistar массой l80-220 г, которых содержали в виварии ГУ НИИ фармакологии РАМН в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму ad libitum, по 6 особей в клетке в течение 2 нед до начала эксперимента, на стандартной диете при 12-часовом световом режиме. Для эвтаназии крыс применяли декапи-тацию, головной мозг извлекали на льду и выделяли стриатум, гиппокамп и мозжечок по схеме [9].
Радиолигандное связывание in vitro. Все меченые лиганды были получены методом твердофазного катализа в ОХВАВ ИМГ РАН (зав. -акад. РАН Н.Ф. Мясоедов).
a) связывание с ДА-рецепторами. Изучение радиорецепторного связывания с ДА-рецепторами проводили по методу [10] с модификациями. Стриатумы крыс гомогенизировали в 10 мл ледяного (0-4°C) 50 мМ Tris-HCl буфера (рН 7.4 при 4°C), используя гомогенизатор "тефлон-стекло".
Полученную суспензию центрифугировали при 40000 g в течение 20 мин в ультрацентрифуге "Optima L-70K" (Beckman Coulter). После центрифугирования супернатант сливали, осадок ресус-пендировали повторной гомогенизацией в том же объеме буфера, затем вновь центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный осадок ресуспендировали в 10 мл 50 мМ Tris-HCl инкубационного буфера (рН 7.4 при 37°C) с добавлением солей (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2 • 2H2O, 1 мМ MgCl2 • 6H2O) [11] и использовали по 250 мкл в процедуре связывания ^-3Щ-лигандов дофаминовых рецепторов. Полученную мембранную фракцию инкубировали с [G-3H]-SCH23390 (удельная активность 60 Ки/ммоль), ^-3Щ-спипероном (95 Ки/ммоль), 7-ОН-^-3Щ^РАТ (120 Ки/ммоль). При связывании 7-ОН-^-3Щ^РАТ с целью увеличения селективности к D3-рецепторам из реакционной смеси исключали двухвалентные катионы и добавляли 1 мМ Na4EDTA.
^-3Щ-лиганды добавляли в инкубационную смесь в объеме 50 мкл в конечной концентрации 0.1 нМ и инкубировали в течение 20 мин при температуре 37°C [10] с использованием твердотельного термостата "Термит" (НПО "ДНК-технология"). Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого лиганда (20 мкМ), которое составляло 12-14% от общего. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием.
IC50 по отношению к связыванию ^-3Щ-ли-гандов определяли при добавлении в инкубационную среду 50 мкл исследуемых соединений в конечных концентрациях в диапазоне 10-3-10-8 М. Объем инкубационной смеси составлял 500 мкл. Процесс связывания останавливали путем добавления 2 мл ледяного 50 мМ Tris-HCl буфера и быстрой фильтрации через стекловолоконные фильтры типа Gf/B (Whatman) с последующей промывкой ледяным буфером общим объемом 14 мл. Фильтры предварительно смачивали перед экспериментом в ледяном 50 мМ Tris-HCl буфере в течение 3 ч.
Фильтры высушивали в течение 12 ч при комнатной температуре, затем помещали в сцинтил-ляционную жидкость (реактив Брея) объемом 4 мл и использовали для сцинтилляционного счета. Радиоактивность каждой пробы измеряли в течение 2 мин на сцинтилляционном счетчике Wallac 1411. Эффективность счета составляла 40-45%.
б) связывание с NMDA-рецепторами. Изучение связывания на NMDA-подтипах рецепторов производили согласно методу [12] с модификациями. Использовали меченный тритием МК-801 (дизоцилпин) с удельной активностью 210 Ки/моль. Ткань гиппокампа или мозжечка гомогенизиро-
вали в гомогенизаторе Поттера ("тефлон-стекло") в 10 объемах 5 мМ HEPES/4.5 мМ трис-буфе-ра (рН 7.6), содержащего 0.32 М сахарозу (буфер 1). Гомогенат разбавляли до 50 объемов буфера для исследования 2 (5 мМ HEPES/4.5 мМ трис-буфера рН 7.6 и центрифугировали 10 мин при 1000 g. Супернатант отбирали и вновь центрифугировали 20 мин при 25000 g. Осадок гомогенизировали в 50 объемах буфера 2 и центрифугировали 20 мин при 8000 g. Супернатант и его мягкий, зыбкий надслой отбирали и центрифугировали 20 мин при 25000 g. Полученный осадок суспендировали в буфере 3 (5 мМ HEPES/4.5 мМ трис-буфера, содержащего 1 мМ Na4EDTA (рН 7.6)), и суспензию вновь центрифугировали. Такую процедуру отмывки проводили четырежды, причем при последней отмывке EDTA был исключен из состава. Конечный осадок ресуспенди-ровали в 5 объемах буфера 2 и сохраняли в жидком азоте. Реакционная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержала 200 мкл буфера 2, 50 мкл меченого лиганда (50 нМ р.р.) и 250 мкл белковой суспензии. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого лиганда.
Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолок-нистые фильтры GF/B (Whatman), предварительно смоченные в 0.3%-ном полиэтиленимине в течение 2 ч при 4°С. Каждую пробирку промывали один раз холодным буфером 2, затем фильт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.