УДК 631.46:631.559:633.31/37
ИЗУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АССОЦИАЦИЙ ЭНДОФИТОВ КЛУБЕНЬКОВ, СПОСОБСТВУЮЩИХ УВЕЛИЧЕНИЮ ПРОДУКТИВНОСТИ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ
© 2010 г. С.Р. Гарипова1, Д.В. Гарифуллина2, О.В. Маркова1, Н.В. Иванчина2, Р.М. Хайруллин2
1Башкирский государственный университет 450074 Уфа, ул. Валиди, 32, Россия 2Башкирский государственный аграрный университет 450001 Уфа, ул. 50-летия Октября, 34, Россия E-mail: garisveta@rambler.ru
Поступила в редакцию 24.02.2010 г.
Исследовали эндофитные бактерии, выделенные из клубеньков растений гороха (Pisum sativum L.) и фасоли (Phaseolus vulgaris L.), на способность проявлять антагонизм к Fusarium oxysporum sp. и Bipolaris sorokiniana и стимулировать рост корней растений. Обнаружены ассоциации, сохранившие при пересевах в своем составе ризобии и способствовавшие в полевых условиях увеличению семенной продуктивности растений на 30%. В зависимости от почвенно-климатических условий и сорта растения-хозяина у инокулированных растений различались эффективность симбиотрофного питания и способность к снижению заболеваемости растений корневыми гнилями.
Ключевые слова: бактериальные ассоциации, бактериальные эндофиты, корневые клубеньки, горох, фасоль.
ВВЕДЕНИЕ
Одним из путей экологически ориентированного управления агроэкосистемой является использование микроорганизмов комплексного биологического действия, находящихся в мутуалистических связях с сельскохозяйственными растениями. К числу таких организмов, наряду с клубеньковыми бактериями, везикулярно-арбускулярной микоризой и ризосферными PGPR-бактериями (plant growth promoting rhizobacteria), относятся и эндофитные бактерии, населяющие внутренние ткани растения и находящиеся с макросимбионтом в нейтральных или взаимополезных отношениях.
С тех пор как в середине ХХ столетия появились первые сообщения о существовании непатогенных бактерий, населяющих внутренние ткани корней растений [1-3], было обнаружено, что эндофитные бактерии встречаются во всех органах растения. Они были выделены из цветков, плодов, стеблей, листьев, семян, семяпочек, корней разных видов растений [4-6], в том числе и из клубеньков бобовых растений [7-12], в которых численность культивируемых бактерий, не относящихся к Rhizobiaceae, составляла от 104 [7] до 107 КОЕ/г клубенька [13].
С активным применением молекулярно-генети-ческих методов идентификации микроорганизмов
стало возможным осуществлять анализ как культивируемых, так и некультивируемых бактерий. На сегодняшний день список бактерий-эндофитов включает 219 видов, относящихся к 71 роду, из которых наиболее распространенными являются Bacillus и Pseudomonas [14]. В бобовых растениях помимо вышеназванных родов были обнаружены представители Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Chryseomonas, Curtobacterium, Enterobacter, Erwinia, Flavimonas, Klebsiella, Methylobacterium, Pantoea, Sphyngomonas, Xanthomonas [7, 12, 15-17].
В самых ранних сообщениях бактериальные эндофиты рассматривались как артефакт недостаточно полной поверхностной дезинфекции тканей растения, или их относили к скрытым патогенам. В настоящее время показано, что многие эндофит-ные бактерии обладают полезными свойствами: обеспечивают защиту растения от болезней [15-17, 18-21], способны к азотфиксации [22-24], выделяют различные физиологически активные вещества, влияющие на рост, развитие растений [13, 25] и имеют также высокий потенциал применения в медицине и биотехнологии [26-28]. На сегодняшний день, несмотря на широкий ассортимент бактериальных препаратов, применяемых в агробиотехно-логии, средства воздействия на основе эндофитных бактерий немногочисленны: например, препараты
фунгицидного действия фитоспорин (ООО НВП "БашИнком"), интеграл (ЗАО "Элита комплекс") на основе Bacillus subtilis [29], RhizoStarR на основе Serratia plymuthica [17]. Учитывая эволюционную, экологическую, физиологическую роль бактериальных эндофитов в растительно-микробных взаимоотношениях, актуальным является расширение использования их полезного потенциала в сельскохозяйственной практике [6, 20, 30, 31].
Цель работы - изучение эндофитных бактериальных ассоциаций, выделенных из клубеньков гороха и фасоли, способных подавлять рост фито-патогенов, стимулировать рост корней и обеспечивать высокую продуктивность растений в полевых условиях.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы растения гороха (Pisum sativum L.) сортов Орлус и Чишминский-95 и фасоли (Phaseolus vulgaris L.) сортов Уфимская, Золотистая, Эльза. Из клубеньков этих растений были выделены ассоциации эндофитных бактерий. Бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viceae штаммы 1078 и 1061, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli штамм 2630 были получены из Всероссийской коллекции непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВНИИСХМ, С.-Петербург). В качестве возбудителей корневых гнилей использовали Fusarium oxysporum (Schlecht) f. sp. pisi (Hal.) и Bipolaris sorokiniana Sacc. (Shoem) -штаммы из коллекции Башкирского ГАУ.
Для выделения бактериальных ассоциаций из клубеньков бобовых растений были взяты здоровые растения, выращенные в полевых условиях на черноземе выщелоченном (горох) и серой лесной почве (фасоль). Корни гороха отбирали в фазе бутонизации растений, корни фасоли - в фазе созревания семян. Клубеньки отделяли от тщательно промытых корней, помещали на 15-20 мин в 0.2% раствор диаци-да (этанолмеркурхлорид + цетилпиридиния хлорид в соотношении 1:2), который удаляли пятикратной промывкой клубеньков в стерильной дистиллированной воде. Каждый клубенек смачивали спиртом, обжигали в пламени спиртовки 2-3 сек и помещали в 0.2 мл стерильной воды в асептических условиях в лунки репликатора. Для контроля чистоты поверхностной стерилизации на бобовый и мясо-пептон-ный агар репликатором делали посев смыва с клубеньков без раздавливания. Стержнями на крышке репликатора механически разрушали клубеньки и наносили отпечаток соответствующих суспензий на чашки Петри с бобовым агаром. Затем ставили отпечатки на ту же среду с добавлением за 1 ч до
посева бактерий суспензии Fusarium oxysporum sp. и отдельно Bipolaris sorokiniana. Крышку репликатора между отпечатками стерилизовали в пламени и остужали, контролировали чистоту стерилизации между посевами в каждой серии. Зоны подавления гриба вокруг выросших колоний изолятов измеряли от края колонии бактерий на 3-7-е сутки.
Для оценки ростстимулирующих свойств бактериальных ассоциаций суспензии каждого изолята клубенька из репликатора разводили в 20 мл стерильной воды и инокулировали ими семена рапса, в каждом варианте по 30 семян. Инкубацию проводили в темноте при комнатной температуре в течение 2-х сут. Ростстимулирующий эффект изолятов оценивали по удлинению корня растений рапса по сравнению с контролем (вода без бактерий).
Мелкоделяночные полевые опыты по инокуляции гороха и фасоли проводили в течение 2007-2008 гг. в различных почвенно-экологических условиях Республики Башкортостан (РБ). Были выбраны 3 участка, расположенные на территории северной (Иглинский район РБ) и южной (Уфимский район РБ) лесостепной зон Южного Предуралья. Содержание гумуса определяли по Тюрину, подвижного фосфора - по Чирикову, азота щелочногидролизуе-мого - по Корнфилду, pH - потенциометрическим методом. Агрохимическая характеристика почв экспериментальных участков представлена в табл. 1. Участки различались по уровню содержания азота и подвижного фосфора в почве, по сумме эффективных температур > 15°C: 237 °C (Иглинский район РБ) и 265 °C (Уфимский район РБ) соответственно. На серой лесной почве опытный участок располагался в зоне защитного действия лесополосы, которая смягчала дефицит влаги. Во всех опытах посеву предшествовала распашка залежного (1-2 года) участка.
Горох высевали с нормой высева 25 шт./м при ширине междурядья 20 см, фасоль - 15 шт./м и шириной междурядья 45 см. Учетная площадь делянки составляла для посева гороха 1 м2, фасоли -3 м2. Делянки размещали рендомизированно в 4-х повторностях. Инокуляцию семян проводили непосредственно перед посевом жидкой суспензией микроорганизмов (смыв стерильной водопроводной водой) в 2007 г. при плотности 1010 кл./семя, в последующий год - при плотности 107 кл./семя. Контролем служили семена, обработанные эквивалентным количеством стерильной водопроводной воды.
Вегетационный период 2007 г. характеризовался благоприятными условиями для роста и развития растений. Осадков за вегетацию выпало больше нормы. Накопление сумм эффективных температур,
Таблица 1. Агрохимическая характеристика опытных участков, использованных для оценки эффекта бактериальных обработок семян Pisum sativum L. и Phaseolus vulgaris L.
Почва Гумус, % Р подв' мг/100 г почвы N , щелочногидр' мг/кг почвы РНН2О
Чернозем 8.12 12.1 203 6.8
типичныи
Чернозем 6.83 7.4 182 6.4
выщелоченный
Серая лесная 4.46 5.1 152 5.9
почва
особенно во 2-й половине вегетационного периода шло с превышением многолетней нормы. В 2008 г. лимитирующим фактором вегетационного периода являлся существенный недостаток влаги в первой половине вегетации растений.
Объем выборки данных в процессе вегетации составил 24 растения, в стадии созревания - 60 растений. Статистические сравнения проводили по ¿-критерию Стьюдента, характер зависимости между сравниваемыми параметрами оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона. В таблицах с данными полевых опытов приведены средние величины показателей и их стандартные ошибки при Р = 0.95 в пересчете на одно растение.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что при выделении бактерий из клубеньков бобовых растений, даже при тщательной стерилизации поверхностных тканей клубенька, часто обнаруживается спонтанная микрофлора, не относящаяся к ризобиям. Возникает вопрос о неслучайности этого микробного сообщества, ассоциированного с внутренними тканями клубеньков, и возможной его роли в симбиозе с растением. Понятие эндофитности широко обсуждается в литературе [31, 32]. Для непатогенных бактерий, выделенных из внутренних тканей растений, но для которых не получены визуальные (при микроскопии) свидетельства локализации бактер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.