ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 3, с. 396-403
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:57.021
ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ СЕЛЕНА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ И АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ В ПРОРОСТКАХ КУКУРУЗЫ © 2015 г. П. А. Полубояринов*, Н. А. Голубкина**
*ФГБОУВПО "Пензенский государственный университет архитектуры и строительства", Пенза **Всероссийский НИИ селекции и семеноводства овощных культур, Москва Поступила в редакцию 06.10.2014 г.
Исследовано выделение элементного селена на поверхности корней проростков кукурузы (Zea mays L., сорт Краснодарский 29/АМВ) при добавлении в раствор Кнопа селенорганического препарата ДАФС-25 (диацетофенонилселенид) и отмечено ингибирование роста корней. Добавление к раствору, содержащему ДАФС-25 (10-2 г/л), цистеина полностью подавляло выделение селена на поверхности корней и ослабляло степень ингибирования роста. Отмечено влияние ДАФС-25 на азотистый обмен: повышалось содержание белковой фракции альбуминов в корнях почти в 2 раза за счет снижения содержания фракции глютелинов на 43%, проламинов на 25% и глобулинов на 26%. В варианте ДАФС-25+цистеин количественный состав белков был наиболее близок к контролю, что говорит о действии цистеина как антидота. На содержание альбуминов в надземной части проростков кукурузы препарат ДАФС-25 оказывал сходное воздействие: резко повышалось содержание альбуминов в (4.5 раза) на фоне увеличения общего содержания белков. Кроме того, препарат ДАФС-25 в самой высокой концентрации стимулировал активность фермента пе-роксидазы как в корнях (на 63%), так и в надземной части проростка кукурузы (на 112%). Добавление цистеина в раствор сильно снижало активирующее действие препарата ДАФС-25 на пероксида-зу. Оценка содержания селена в корнях и в надземной части проростков контрольного варианта показала, что они содержали незначительное количество селена. В варианте с препаратом ДАФС-25 содержание селена было наивысшим, что говорит о распаде препарата непосредственно на поверхности корней проростков. Повышенное содержание селена обнаружили и в корнях, и в надземной части. Добавление цистеина снижало содержание селена в тканях проростков кукурузы.
Ключевые слова: Zea mays - проростки - корни - метаболизм селена - цистеин - диацетофенонилселенид - сульфгидрильные группы - ацетофенон - альбумины - пероксидаза
DOI: 10.7868/S0015330315030161
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время активно изучаются биохимия и фармакология селенорганических соединений. Установлена противоопухолевая, противовирусная, антимикробная, антиоксидантная, антитоксическая активность органических соединений селена [1]. Проводятся работы по созданию новых селенорганических препаратов, оказывающих лечебное и профилактическое действие при селендефицитных состояниях. Однако единой стройной теории биохимической функции селена и механизма метаболизма раз-
Сокращение: ДАФС-25 - 1,5-дифенил-3-селенапентадион-1,5 (диацетофенонилселенид).
Адрес для корреспонденции: Полубояринов Павел Аркадьевич. 440028 Пенза, ул. Германа Титова, 28. Пензенский государственный университет архитектуры и строительства. Электронная почта: poluboyarinovpavel@mail.ru
личных препаратов селена, в том числе органических, до настоящего времени нет.
Имеющаяся сумма данных свидетельствует о существовании эндогенного регулирования го-меостаза селена в растениях [2]. Так, аналогично животным, для растений характерно накопление селена в репродуктивных органах [3], а также в быстро развивающихся тканях [4]. Аккумулирование селена происходит преимущественно в эк-зокарпии плодов, перикарпии семенной кожуры зерна, перидерме клубней, протодерме луковиц. Есть предположение, что "феномен пограничного накопления селена" [2] обусловлен тем, что селен выполняет защитную антиоксидантную роль.
Селен в растениях находится в виде неорганических (селенатов, селенитов) и органических соединений (аминокислот, белков). Растения способны усваивать и трансформировать различные
формы селена: неорганические в органические и обратно [5, 6]. В растениях-аккумуляторах селена наблюдается интенсивное образование метилированных форм элемента [7, 8]. Для органических форм селена характерным является то, что в корнях их больше, чем в стебле и первом листе. Отмечалось также наличие органического селена в точках роста [9].
Метаболизм органических соединений селена мы изучали на примере селенорганического препарата ДАФС-25 (диацетофенонилселенида), синтезированного в НИИ химии СГУ им. Н.Г. Чернышевского. ДАФС-25 обладает выраженной анти-оксидантной, антитоксической, иммуномодули-рующей активностью и успешно применяется в птицеводстве и животноводстве в ряде регионов России [10].
Из литературы известно о повышении скорости роста и увеличении общей и рабочей поверхности корневой системы у растений пшеницы при добавлении препарата ДАФС-25 в питательные растворы [11]. Также отмечалось стимулирующее влияние некоторых концентраций ДАФС-25 на рост и развитие растений козлятника восточного (Galega orientalis) [12].
В работах [13, 14] показано, что препарат ДАФС-25 распадается на ацетофенон и элементный селен под действием сульфгидрильных (тиольных) групп растущего мицелия грибов Aspergillus niger Tiegh. и Botrytis cinerea Pers. При этом элементный селен адсорбируется на поверхности гиф грибов. Необходимым компонентом этой реакции является наличие веществ, содержащих сульфгидрильную группу, — восстановленного глутатиона или цистеина.
Известно, что при стрессовых состояниях, вирусном или микробном инфицировании организма значительно изменяется активность перокси-дазы. Кроме того, пероксидаза как гемсодержа-щий фермент ингибируется цианидами, азидами и сульфидами. Пероксидаза (КФ 1.11.1.7) относится к классу оксидоредуктаз с простетической группой, содержащей феррипроторфирин IX; широко распространена в животных и растительных клетках (фермент может находиться как в связанном с клеточной стенкой состоянии, так и в цитоплазме); участвует в энергетическом обмене, фотосинтезе, трансформации пероксидов и веществ, чужеродных организму.
Целью работы явилось изучение возможности реакции препарата ДАФС-25 с сульфгидрильны-ми группами корней проростков кукурузы и влияние препарата на рост корней и содержание фракций белков. Проростки кукурузы представляют собой наиболее удобный объект для эксперимента благодаря скорости прорастания и четкой зависимости скорости роста от наличия в растворах различных фитотоксичных веществ.
Также на проростках кукурузы удобно изучать системное действие препаратов на активность гем-содержащего фермента — пероксидазы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проростки кукурузы (Zea mays L.) сорта Краснодарский 29/АМВ выращивали, как описано в работе [15]. Корни интактных проростков в возрасте 3 суток погружали на 1 ч в раствор Кнопа с препаратом ДАФС-25. В эксперименте использовали ацетоновый раствор препарата ДАФС-25 (1, 5-дифенил- 3-селенапентадион-1,5), который добавляли в раствор Кнопа в различных концентрациях. Контролем служил раствор Кнопа с добавлением растворителя — ацетона. Через 24 ч измеряли длину корней в опыте и контроле и рассчитывали по формуле ингибирование роста (ИР, %) корней препаратом ДАФС-25:
ИР = 100 - [(Дх - Дн)/( Дк — Дн)] х 100,
где Дх — средняя длина корней проростков через 24 ч в опыте (мм); Дк — средняя длина корней проростков через 24 ч в контроле (мм); Дн - средняя начальная длина корней проростков (мм).
Для определения фракций белков (альбуминов, глобулинов, проламинов и глютелинов) и активности пероксидазы неотделенные корни кукурузы погружали в растворы Кнопа, содержащие препараты ДАФС-25 в разных концентрациях на 3 суток. Затем проростки разделяли на корни и надземную часть (далее проростки), измельчали, растирали и центрифугировали. Белки экстрагировали по методу Ермакова—Дурыниной [16, с. 365-370]. Содержание отдельных фракций белков определяли по методу Bradford [17]. Контролем служили проростки кукурузы, корни которых находились в растворе Кнопа без добавления препаратов.
Изучение анатомии клеток корней кукурузы проводили под микроскопом Levenhuk D320L ("Левенгук", Россия).
Выделение элементарного селена определяли качественной реакцией на селен по Файглею и Весту [18].
Активность пероксидазы определяли по методу Бояркина (фотометр КФК-3) при длине волны 610 нм. Метод основан на измерении времени, за которое в опытном растворе достигается определенная оптическая плотность (E = 0.250). Затем рассчитывали изменение оптической плотности за 1 с в расчете на 1 г сырой ткани. В качестве субстрата использовали бензидин, в результате окисления которого образуется соединение синего цвета [19].
Общее содержание селена в корнях и проростках кукурузы определяли флуориметрическим методом с диаминонафталином [20].
Рис. 1. Вид клеток корней проростков кукурузы при увеличении 100х.
а — контроль; б — 10-2 г/л ДАФС-25 в растворе Кнопа; в — после смывания селена 1% Na2S.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Визуальная оценка показала, что через сутки корни растений кукурузы, находящиеся в растворе с препаратом ДАФС-25 в самой высокой концентрации — 10-2 г/л, становились красными, что говорит о выделении элементарного селена.
Под микроскопом при увеличении 100х видно, что на поверхности корней проростков отлагают-
ся структуры, напоминающие гранулы, содержащие элементный селен и отсутствующие в контроле. По внешнему виду клеток можно сказать, что они как будто "облеплены" гранулами селена (рис. 1а и 1б). Также можно отметить плазмолиз клеток корней под действием ДАФС-25, т.е. препарат увеличивает водопроницаемость клеточных мембран. Такое действие характерно для многих ингибиторов сульфгидрильных групп [21].
Селен легко смывается 1% раствором №28. При этом цвет клеток становится практически исходным (рис. 1в).
В варианте ДАФС-25+цистеин выделение селена на поверхности корней кукурузы ни визуально, ни при микроскопировании не наблюдали. В этих опытах гранулы элементного селена обнаруживали в растворе (их можно было видеть под микроскопом), что свидетельствует о непосредственном взаимодействии ДАФС-25 с цисте-ином и о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.