РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 29-33
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТОВ КИССПЕПТИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФОРМИРОВАНИЯ АДАПТИВНЫХ Treg
и ТШ7 IN VITRO
© 2014 г. О.Л. Горбунова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Поступила: 10.01.2014. Принята: 21.01.2014
Изучали роль нового гормона — кисспептина в регуляции формирования адаптивных субпопуляций Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) и субпопуляции интерлейкин (Ш)-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17). Показано, что кисспептин усиливает формирование адаптивных Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) (CD4+FOXP3 + ) из TGF-P1 (трансформирующий фактор роста в1)-примированных CD4+Т-лимфоцитов и экспрессию на них CTLA-4 (CD4+CTLA4+FOXP3+) и GITR (CD4+CTLA4+GITR+). В отношении Th17 установлено, что кисспептин снижает экспрессию RORyt и IL-17A СD4+Т-лимфоцитами. Таким образом, кисспептин, увеличивая количество Treg и их функциональную активность (экспрессия CTLA-4 и GITR), параллельно угнетая Th17, является индуктором формирования иммунологической толерантности на периферии, непосредственно контролируя баланс Treg/Th17.
Ключевые слова: кисспептин, Th17, Treg, беременность
ВВЕДЕНИЕ
Недавно получены данные о важной роли нового гормона — кисспептина в процессах репродукции. Кисспептин относится к семейству пептидов, транслируемых с гена КК8-1. Протеолитическая обработка пептида-предшественника кисспептина приводит к появлению более коротких кисспептинов, которые и обладают биологической активностью. Кисспептины продуцируются нейронами, локализованными в ядрах гипоталамуса. Экспрессия К№5-1 в этих нейронах избирательно регулируется половыми стероидами, обеспечивая механизм, через который тестостерон или эстрогены регулируют выброс гонадотропин-рилизинг-гормона [1, 2].
В кровообращении мужчин и небеременных женщин кисспептин обнаруживается в низких концентрациях [3]. Значительное повышение кисспептина выявлено при бе-
Адрес: 614081 Пермь, ул. Голева, 13, ФГБУН ИЭГМ УрО РАН, Горбуновой О.Л. E-mail: olia15_77@mail.ru
ременности. Плацента является источником высокого уровня циркулирующего кисспеп-тина [3]. Беременность, будучи феноменом естественной аллотрансплантации, характеризуется наличием эффективных регу-ляторных механизмов для предупреждения возможных антифетальных иммунных реакций [4]. Одним из наиболее значимых механизмов обеспечения толерантности является повышение числа адаптивных Т-регуляторных лимфоцитов (Тгед) периферической крови при снижении уровня ин-терлейкин-17-продуцирующих (1Ь-17) лимфоцитов (Тк 17) [5]. Тгед позиционируются как «истинные супрессоры», угнетающие иммунные реакции вследствие индукции иммуносупрессорного катаболизма триптофана, что приводит к формированию специфической толерантности и во многом определяет успешное протекание беременности, аллогенной трансплантации, а также эффективный контроль аутоиммунных реакций [6]. Субпопуляция ТЫ7, напротив, инициирует воспалительные, аутоиммунные реакции, а также реакции отторжения трансплантанта [7]. Установлено, что при
спонтанных абортах пропорция Th17, а также продукция IL17 в периферической крови значительно повышается [5]. Формирование адаптивных Treg и Th17 происходит из наивных CD4+Т-лимфоцитов периферической крови. Известно, что гормоны беременности обладают выраженными имму-номодулирующими эффектами, защищая зародыш от агрессии иммунокомпетентных клеток матери [4]. Кисспептин имеет специфические мембранные рецепторы на лимфоцитах человека [8], и в силу этого способен регулировать формирование и функции адаптивных Th17 и Treg, однако в современной научной литературе данные об им-муномодулирующем действии кисспептина единичны [9].
Цель работы — исследование роли кис-спептина на формирование адаптивных Treg и Th17 из CD4+Т-лимфоцитов периферической крови женщин in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток периферической крови 6 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (от 23 до 37 лет). Периферическую кровь забирали из кубитальной вены в фолликулярную фазу менструального цикла (5—11 день), поскольку экспрессия KISS-1R имеет максимум в проэструс [10]. Суспензию мононуклеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3). Далее методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells; «Invitrogen», Норвегия) из суспензии мононуклеаров выделяли CD4+T-лимфоци-ты. Чистота выделения CD4+T-лимфоцитов составила 97 — 98%. Затем клетки инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете (5-106клеток/мл) в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 72 ч при 370С в условиях 5% СО2 с гормоном. Кисспептин (Кисспептин-54, Metastin, Synthetic, CALBIOCHEM, США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови в I, II и III триместрах беременности, — 1,3 пМ/л, 4,6 пМ/л и 9,6 пМ/л, соответственно [11]. В контроль-
ные пробы вместо гормона добавляли официальный растворитель.
Для индукции формирования Treg из CD4+Т-лимфоцитов в культуры добавляли трансформирующий фактор роста Р1 (TGF-p1) (5 нг/мл, «GIBCO», США) [12], магнитные частицы с нанесенными ан-™-CD3/CD28 моноклональными антителами (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen», Норвегия), имитирующими физиологический путь активации Т-клеток через T-клеточный рецептор, а также нейтрализующие анти-IFNy и анти-^-4 монокло-нальные антитела (10 мкг/мл, «eBioscience», США).
После 72 ч инкубации с гормоном снимали супернатанты, удаляли магнитные частицы, и оценивали фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии на цитофлюоримет-ре («Becton Dickinson», США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 72 ч инкубации с гормонами, составляла 95 — 98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител («eBioscience», США). При учете результатов подсчитывали не менее 100000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитар-ного окна использовали соответствующие изотипические контроли.
Поскольку экспрессия транскрипционного фактора FOXP3 (forkhead box P3) является основным маркером Treg, их количество определяли как процент CD4 + FOXP3 + клеток (anti-human Foxp3-PerCy-5.5) в гейте CD4+Т-лимфоцитов. На CD4+FOXP3+ клетках оценивали уровень молекулы CD152 (CTLA-4) (anti-human Foxp3-PerCy-5.5; antihuman CD152-PE) и уровень молекулы CD357 (GITR — глюкокортикоид индуцированный TNF-рецептор) (anti-human Foxp3-PerCy-5.5; anti-human CD357-Alexa Fluor 488) гейте CD4+T-лимфоцитов.
Для индукции формирования Th17 из CD4+Т-лимфоцитов в культуры вносили IL-1 р (10 нг/мл, «eBioscience», США) и IL-6 (10 нг/мл, «eBioscience», США), поскольку по данным литературы именно эти цито-кины стимулируют экспрессию сиротного рецептора у ретиноидов (RORyt) и дальнейшую продукцию IL-17A [13]. Кроме этого добавляли магнитные частицы с нанесенными анти-CD3/CD28 моноклональными
антителами, нейтрализующие анти-IFNy и анти-1Ь-4 моноклональные антитела. Количество Th17 оценивали как процент CD4+Т-лимфоцитов, экспрессирующих RORyt+IL-17A+ (anti-human RORyt-PE; antihuman IL-17A-PerCP-Cy5.5). Учитывая, что во всех тестах выборочное распределение данных, оцениваемое по критерию Фишера, было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали по парному i-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно из рис. 1, кисспептин, в концентрациях, характерных для I-III триместра беременности, усиливает формирование адаптивных Treg (CD4 + FOXP3 + ) из TGF-ßl-примированных CD4+Т-лим-фоцитов и экспрессию на них CTLA-4
(CD4 + FOXP3 + CTLA-4 + )
и
GITR
(CD4 + FOXP3 + GITR+) (табл.). Известно, что молекула CD152 (CTLA-4) конститутивно высоко экспрессируется на Treg, и определяет их супрессорную активность в отношении Т-эффекторных клеток. CTLA-4 необходима для подавления экспрессии костимулятор-ных молекул на дендритных клетках, а стимуляция Treg через CTLA-4 приводит к усилению продукции ими TGF-ß. Экспрессия GITR также повышается при активации Treg и обеспечивает их супрессорные свойства. Взаимодействие GITR со своим лигандом на поверхности дендритных клеток приводит к активации Treg по NF-kB пути [14]. Таким образом, кисспептин увеличивает не только количество Treg, но и их функциональную активность, связанную с экспрессией CTLA-4 и GITR.
Показано, что кисспептин в исследуемых дозах угнетает формирование Th17 из ИЛ-^/ИЛ-6-примированных CD4+T-лим-
CD4+FOXP3+ 1 ^
0,8 0,6 0,4 0,2-| 0
12 3 4
группы исследования
Рис. 1. Влияние кисспептина на индукцию Treg из СВ4 + Т-лимфоцитов периферической крови в системе in vitro
Примечание: по оси ординат — процент РОХР3 + -лимфоцитов в гейте СБ4+Т-лимфоцитов; по оси абсцисс — группы исследования; 1 — контроль; 2 — кисспептин 1,3 пМ/л; 3 — кисспептин 4,6 пМ/л; 4 — кисспептин 9,6 пМ/л.
*достоверные (р<0,05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.
CD4+RORTt+
0,8
0,7.
0,6.
0,5-
0,4-
0,3-
0,2-
0,1-
0-
12 3 4
группы исследования
Рис. 2. Влияние кисспептина на индукцию Th17 из СБ4 + Т-лимфоцитов периферической крови в системе in vitro
Примечание: по оси ординат — процент RORyt+'лимфоцитов в гейте СБ4 + Т-лимфоцитов.
Таблица. Влияние кисспептина на количество Treg /Th17 СЭ4+Т-лимфоцитов периферической
крови женщин in vitro (n = 6)
Эксперимент. воздействие CD4 + FOXP3+ GITR+ (%) CD4 + FOXP3 + CTLA4 + (%) CD4+RORyt+ IL17A+ (%)
Контроль 0,35±0,06 0,33±0,04 0,40±0,03
Кисспептин 0,57±0,07 0,50±0,05 0,27±0,03
1,3 пмоль/л р<0,05 р<0,05 р<0,05
Кисспептин 0,76±0,13 0,67±0,09 0,26±0,02
4,6 пмоль/л р<0,05 р<0,05 р<0,05
Кисспептин 0,78±0,10 0,68±0,11 0,25±0,04
9,6 пмоль/л р<0,05 р<0,05 р<0,05
Примечание: р — достоверность различий по сравнению с контр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.