МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 3, с. 335-343
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.873+57.088.52
ИЗУЧЕНИЕ ФАЗОВО-СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ ФОСФОЛИПИДНЫХ ФРАКЦИЙ АКТИНОБАКТЕРИЙ В СВЯЗИ С УСЛОВИЯМИ ИХ ХРАНЕНИЯ
© 2013 г. С. Н. Филиппова*, Н. А. Сургучева*, Е. В. Ермакова**, М. А. Киселев**, Л. П. Терехова***, О. Н. Синева***, О. А. Галатенко***, А. В. Забелин****, В. Ф. Гальченко*, 1
* Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва ** Объединенный институт ядерных исследований, Дубна *** НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва **** Курчатовский центр синхротронного излучения и нанотехнологий, Российский научный центр "Курчатовский институт", Москва Поступила в редакцию 14.05.2012 г.
Методом дифракции рентгеновских лучей получена информация о фазово-структурной организации фосфолипидных фракций клеточных мембран актинобактерий Streptomyces hygroscopicus RIA 1433, Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata INA 4281, Nonomurea sp. INA 34-06 и стабильности их основных параметров в зависимости от хранения и уровня гидратации. Показано, что фосфолипиды S. hygroscopicus образовывали мультиламеллярные слои достаточно плотной упаковки. Фосфолипидная фракция этого микроорганизма по своей структурной организации отличалась однородностью и стабильностью при хранении в течение 10 мес. при 4°С. Напротив, липи-ды фосфолипидных фракций N. roseoviolacea subsp. carminata INA 4281 и Nonomurea sp. INA 34-06 формировали ламеллярную и инвертированную гексагональную (HII) фазы. При этом их фазовое состояние зависело от уровня гидратации и изменялось в процессе хранения. Предполагается, что выявленные различия в фазово-структурной организации фосфолипидных фракций актинобактерий могут служить показателем стабильности и устойчивости их мембранных структур к условиям длительного хранения.
Ключевые слова: актинобактерии, фосфолипиды, фазово-структурная организация, дифракция рентгеновских лучей.
DOI: 10.7868/S002636561303004X
Использование современных методов консервации микроорганизмов связано с воздействием стрессорных факторов глубокого замораживания и сублимационного высушивания (лиофилиза-ции). Большинство представлений о механизмах повреждения клеток и способах их защиты связано с клеточными мембранами как наиболее чувствительным компонентом консервируемых биологических объектов. Сведения о фазовом состоянии мембранных липидов важны для выяснения механизмов стрессового ответа клеточных мембран на действие повреждающих факторов, а также механизмов взаимодействия защитных сред с мембранными липидами и их роли в стабилизации клеточных мембран [1].
Фосфолипиды — основные структурообразующие компоненты биологических мембран. Клеточные мембраны бактерий, как и мембранные
1 Автор для корреспонденции (e-mail: svfilipova@mail.ru).
структуры эукариотических организмов, имеют бислойную конфигурацию. Поддержание бис-лойности во многом определяется механизмами фазовых переходов мембранных липидов в соответствии с физическими параметрами окружающей среды. Многообразие структурной организации мембранных фосфолипидов экспериментально обнаруживается при фазовых переходах. Наиболее изучен фазовый переход мембранных фосфолипидов из жидкокристаллического состояния в гель с сохранением бислойной структуры мембран. В то же время, значительная часть молекул клеточных фосфолипидов имеет спонтанную кривизну, и такие молекулы не способны формировать плоский бислой. В жидкокристаллическом состоянии эти липиды образуют небислой-ные фазы, такие как гексагональная (На) и кубическая (Ра), которые могут формироваться в условиях нормальных физиологических температур [2]. Способность липидов к фазовым перехо-
дам, очевидно, требуется для оптимизации структурного состояния липидного матрикса, определяющего текучесть, толщину и эластичные свойства бислоя за счет регуляции его гидрофобных и гидрофильных частей применительно к условиям окружающей среды и физиологическому состоянию клетки. Предполагается, что не-бислойные фазовые состояния мембранных ли-пидов необходимы для выполнения определенных физиологических функций, связанных с диффузией, а также при встраивании в мембрану белковых компонентов [2—4]. Показано, что в основе регуляции проницаемости мембранных структур Escherichia coli лежат фазово-переходные механизмы мембранных липидов, включающие формирование небислойных фаз [5]. В поддержании бислойной организации и стабильности мембран важную роль играет клеточная стенка микроорганизмов. Обнаружено, что у мембранных липидов Acholeplasma laidlawii, клетки которого не имеют клеточной стенки, менее выражена тенденция мембранных липидов к образованию не-бислойных фаз [6] по сравнению с клетками E. coli [5], Clostridium butyricum [7], Pseudomonas fluore-scens [8] и Sulfolobus solfataricus [9], окруженными клеточной стенкой. В условиях низкотемпературной консервации уровень дефектности и возможных повреждений поверхностных клеточных структур микроорганизмов возрастает, в связи с чем агрегатное состояние липидных компонентов, находящихся в состоянии перехода в небис-лойные фазы, может вызвать нарушение организации клеточной мембраны, вплоть до ее полной дезинтеграции [2, 10, 11]. Действие различных типов стрессоров на фазовое поведение липидной составляющей клеточных мембран бактерий во многом зависит от состава мембранных липидов, который может изменяться в ответ на изменение температурных условий, уровня гидратации и ионного окружения [12]. Известно, что повышение температуры, присутствие в среде высоких концентраций бивалентных катионов (Mg2+, Ca2+, Sr2+), а также дегидратация в результате непосредственного удаления воды или воздействия осмолитиков индуцирует образование не-бислойных фаз мембранных липидов [13]. При этом, в поддержании бислойной структуры мембраны важную роль играет соотношение "бислойных" и "небислойных" липидов, а также их жирнокислотный состав [1, 5, 11, 14]. Сбалансированность фазового состояния мембранных ли-пидов является одним из важных регуляторных механизмов выживания микроорганизмов [5, 14]. Предполагается, что эффективность защитных сред, используемых для длительного хранения разных групп организмов, обусловлена их способностью поддерживать баланс во взаимодействии между различными классами липидов, между липидами и мембранными белками для со-
хранения бислойной конфигурации и стабильности клеточных мембран в условиях обезвоживания и низких температур [1, 3, 11].
В настоящее время существует целый ряд методов, позволяющих определять основные структурные параметры как искусственных, так и натив-ных мембран. Одними из эффективных методов изучения структурной организации липидной компоненты биомембран при фазовых переходах являются методы дифракции нейтронов и рентгеновских лучей. При этом в качестве модельных систем используют как индивидуальные, очищенные фос-фолипиды, так и экстракты липидов клеточных мембран с разным уровнем гидратации липидов [14—16]. В настоящей работе основное внимание уделено изучению фазовых переходов фракций суммарных фосфолипидов клеточных мембран актинобактерий в условиях, приближенных к условиям хранения микроорганизмов.
Целью работы было изучение методом рентгеновской дифракции фазово-структурной организации фосфолипидных фракций клеточных мембран актинобактерий разных таксономических групп в зависимости от уровня гидратации, а также изучение стабильности основных структурных параметров липидных фракций при хранении.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования были использованы актинобактерии Streptomyces hygro-scopicus RIA 1433T, Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata INA 4281, свежевыделенный из почвы штамм Nonomuraea sp. INA 34-06. Штамм стреп-томицета поддерживали на овсяной агаризован-ной среде с добавлением 0.25% дрожжевого экстракта [17], штаммы нономурий — на овсяном агаре [18]. Для получения биомассы актинобакте-рии выращивали в погруженных условиях на качалке (180 об/мин) при 28°С в течение 4 сут. Для выращивания S. hygroscopicus использовали жидкую питательную среду [19]. Для культур ноному-рий использовали жидкую модифицированную органическую среду № 2 Гаузе (%): триптон — 3, пептон — 0.5, глюкоза — 1.0, NaCl — 0.5, pH 7.2. Мицелий осаждали центрифугированием, промывали буферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl и 2 мМ ЭДТА, рН 7.0. В качестве лизирующего агента использовали лизоцим марки Б ("Реахим", РФ) в концентрации 4—5 мг/мл. Белки разрушали протеолитическим ферментом, проназой (250 мкг/мл), после чего добавляли ДНКазу и РНКазу в концентрации 10 мкг/мл. Мембранную фракцию получали ультрацентрифугированием при 22000 g в течение 30 мин на центрифуге Beckman. Чистоту препаратов мембранных фракций проверяли с использованием фазово-кон-трастной и электронной микроскопии (JEM-100CXII, "JEOL", Япония). Липидную фракцию с
Состав фосфолипидов клеточных мембран актинобактерий
Содержание, % от суммы фосфолипидов
Фосфолипиды Streptomyces hygroscopicus RIA1433T Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata INA 4281 Nonomuraea sp. INA 34-06
Фосфатидилглицерин 61 <1 14.0
Фосфатидилинозит 22 0 0
Фосфатидилсерин 14 <1 <1
Фосфатидилэтаноламин 0 81 72
Лизофосфатидилэтаноламин 0 4 3
Аминосодержащий фосфолипид 0 8 5
Фосфатидная кислота 2 4 4
Неидентифицированные липиды 1 2 2
преимущественным содержанием фосфолипидов выделяли по методике О'Доннелла и соавт. [20]. Основные компоненты фосфолипидных фракций определяли с помощью одномерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе растворителей хлороформ—метанол—вода (65 : 30 : 5; об.) и двумерной ТСХ в двух системах растворителей: хлороформ— метанол—вода (65 : 25 : 4; об.) и хлороформ-мета-нол-25% аммиак (65 : 25 : 5; об.) на пластинках "Silufol" и "Merck" на стеклянной основе. Для идентификации фосфолипидов использовали универсальные специфические проявители: 5% раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле, 0.2% раствор нингидрина в этаноле, пери-одат-реактив Шиффа. Был использован ряд свидетелей фосфолипидов - фосфатидилглице-рин, фосфатидилэтаноламин, фосфатиди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.