МЕТОДИКА
Гравилат городской (Geum urbanum L.) - многолетнее травянистое растение сем. розоцветных (Rosaceae), широко распространенное в Европейской части России, Западной Сибири и Средней Азии.
Семена гравилата городского были предоставлены нам сотрудниками Проблемной лаборатории Брянской государственной инженерно-технологической академии. Семена стерилизовали 10 мин в растворе 13%-ной перекиси водорода в этаноле, после чего высевали в перлит и поливали в процессе роста растений 1/10 нормы питательной среды Джонсона, модифицированной по Winter [7]. В возрасте 2 нед. (2 настоящих листа) растения рассаживали по одному в 0.5-литровые сосуды с полной дозой той же питательной среды. В условиях водной культуры растения выращивали в камере фитотрона при 14-часовом световом периоде и освещенности 350 мкмоль/(м2 с) натриевыми лампами Reflax-250 (Россия). Температура воздуха - 23 ± 1°C/16 ± 1°С (день/ночь), относительная влажность воздуха (ОВ) - 55/70% (день/ночь).
После образования 5-6 настоящих листьев растения гравилата подвергали засолению. Одну группу растений переносили на питательный раствор NaCl в концентрации 300 мМ и выращивали в течение четырех суток (солевой шок) (рис. 1а). Вторую группу растений подвергали постепенному засолению, ежедневно увеличивая концентрацию соли на 100 мМ до достижения конечной концентрации 400 мМ NaCl (постепенное засоление) (рис. 16). Розетки листьев и корни фиксировали жидким азотом через каждые 24 ч в течение всего опыта, и хранили при -70°С.
Содержание ионов Cl- определяли потенцио-метрическим методом на ионном анализаторе Orion Research Expandable Ion Analyzer EA940 ("Orion", США) при помощи комбинированного хлоридного электрода (Orion Research, модель 96-17B).
Содержание ионов Na+ и К+ определяли фотометрическим методом на пламенном фотометре Carl Zeiss, модель III ("Carl Zeiss", Германия).
Экстракцию свободного пролина и его определение проводили по методу [8].
Для определения активности супероксиддис-мутазы (СОД) (EC 1.15.1.1) и трех форм перокси-дазы (ПО) (EC 1.11.1.7) образцы растений растирали в жидком азоте с нерастворимым поливинилпир-ролидоном, экстрагировали 0.066 М К-фосфатным буфером, рН 7.4, содержавшим 0.01 М дитиотрей-тола, 0.005 М фенилметилсульфонилфторида в диметилсульфоксиде, затем центрифугировали 20 мин при 8000 об./мин и 4°С (Biofuge, "Heraeus", Германия), осадок дважды промывали 0.066 М К-фосфатным буфером, рН 7.4, с последующим
центрифугированием в тех же условиях. Из полученного супернатанта 1 отбирали аликвоты для определения активности СОД и свободной ПО. Для экстракции ион-связанной пероксидазы осадок ресуспендировали в 1 M растворе NaCl в 0.066 М К-фосфатном буфере, рН 7.4, центрифугировали 20 мин при 8000 об./мин и 4°С, осадок дважды промывали 0.066 М К-фосфатным буфером, рН 7.4, и центрифугировали в тех же условиях. Супернатант 2 использовали для определения активности ион-связанной ПО. Для экстракции ковалентносвязанной ПО осадок ресуспендировали в 1 M раствор NaCl с 0.1% Тритона X-100 в 0.066 М К-фосфатном буфере, рН 7.4, центрифугировали 20 мин при 8000 об./мин и 4°С. Супернатант 3 использовали для определения активности ковалентносвязанной ПО.
Общую активность СОД определяли по методу [9]. Реакционная смесь объемом 2 мл содержала: 0.1 мл супернатанта 1, 1.63 мл 50 мМ Трис-HCl-буфера, рН 7.8, 0.2 мл 0.1 М DL-метионина, 0.063 мл 1.7 мМ нитросинего тетразолия ("Sigma", США), 0.047 мл 1%-ого Тритона X-100 и 0.06 мл 0.004%-ного рибофлавина. Реакцию проводили при освещении люминесцентными лампами модель F36W/54 ("Philips", Венгрия) в течение 30 мин. Поглощение раствора измеряли при 560 нм на спектрофотометре GENESYS-10uv ("Thermo Electron Corporation", США).
Активность трех форм гваякол-зависимых ПО определяли по методу [10]. Поглощение раствора измеряли при 470 нм на спектрофотометре GENESYS-10uv.
Концентрацию белка в полученных ферментных препаратах измеряли по методу Esen [11].
Экстракцию свободных ПА из растительного материала и определение их в виде бензоильных производных проводили методом ВЭЖХ [12].
Данные получены в 4 биологических и 3 аналитических повторностях. Обработка данных проведена методами математической статистики [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Стрессорная реакция гравилата на засоление NaCl проявлялась через двое суток действия постепенного засоления и солевого шока (300 мМ NaCl) и выражалась в подвядании молодых листьев. Дальнейшее увеличение концентрации соли до 400 мМ сопровождалось гибелью растений.
На рис. 1 (в-е) представлены данные по динамике накопления ионов Na+ и Cl- листьями и корнями гравилата городского при действии двух типов засоления. Уже через сутки действия шокового засоления содержание ионов Na+ в листьях увеличивалось. При постепенном засолении увеличение содержания ионов Na+ наблюдали лишь спустя двое суток. Динамика накопления ионов
и
о к к
се
Н &
о и о О
л
8
л £
О &
о
24 48 72 Время, ч
96
0
Время, ч
Рис. 1. Схема эксперимента (а, б), динамика накопления ионов натрия (в, г) и хлора (д, е) растениями гравилата городского при действии двух типов засоления.
а, в, д - шоковое действие 300 мМ №С1; б, г, е - постепенное действие №С1 (100-400 мМ). 1 - корни, 2 - листья.
С1- в листьях гравилата в обеих схемах опыта носила сходный характер с таковой для ионов Ка+. Наибольшее содержание ионов Ка+ в листьях при постепенном засолении составляло 0.6, а С1- -1.0 мкмоль/г сырой массы, тогда как при шоковом действии КаС1 - 1.9 и 2.5 мкмоль/г сырой массы соответственно, т.е. максимальное содержание исследованных ионов в листьях при солевом шоке было почти в три раза выше, чем в условиях постепенного засоления.
По сравнению с листьями, корни практически не накапливали ионов Ка+ и С1- ни при шоковом, ни при постепенном засолении. В условиях солевого шока содержание этих ионов было в два-три раза, а в условиях прогрессирующего засоления в 10 раз ниже, чем у галофитов Mesembryanthemum crystallinum [4] и Thellungiella halophila [14]. Полученные данные косвенно свидетельствовали о способности гравилата адаптироваться к шоковому и постепенному засолению.
25
л
к к
ч ^
° м
рН & о о к к
се
Я й20
&15
„¡н
^ Л
& ч
о о
о ^
О
10
м
2 5
(б)
^ о
м 8 ч
о ю
н м
се
« 4
о л н
О о
о 2 к я к
Н « 0
с
24 48 72 Время, ч
96
24 48 72 Время, ч
96
Рис. 2. Динамика накопления свободного пролина (а, б) и изменения активности СОД (в, г) в растениях гравилата городского при действии двух типов засоления.
а, в - шоковое действие 300 мМ №С1; б, г - постепенное действие №С1 (100-400 мМ). 1 - корни, 2 - листья.
0
Я 10
6
0
0
Одной из стресс-индуцируемых ответных реакций растений является аккумуляция пролина. При увеличении содержания ионов Ка+ в листьях и корнях и ингибировании в этих условиях биохимических процессов растение синтезирует и аккумулирует органические соединения, защищающие белки от повреждающего действия этих ионов. Одним из наиболее известных и широко распространенных защитных низкомолекулярных соединений является пролин [4]. Растения гравилата отвечали на повышение содержания ионов Ка+ и С1- интенсивной аккумуляцией пролина в листьях (рис. 2а, 26). В условиях шокового засоления в листьях происходило 10-15-кратное увеличение содержания свободного пролина уже в первые сутки. За тот же период при постепенном засолении уровень пролина возрастал лишь в 1.5-2 раза (рис. 26). В последующие двое суток при солевом шоке содержание пролина продолжало увеличиваться более интенсивно, чем при постепенном засолении, и достигало максимального уровня через 72 ч, затем резко снижалось. Резкое падение содержания пролина в данном
случае могло быть следствием солевого ингиби-рования биохимических процессов его синтеза. Соотношение между содержанием пролина в корнях и листьях при шоковом и постепенном засолении составляло 1 : 15 и 1 : 5 соответственно (рис. 2а, 26). Совокупность приведенных выше результатов по динамике накопления пролина у гравилата в норме и при стрессе свидетельствует о том, что у данного вида имеет место не конститутивный, а стресс-индуцируемый синтез пролина, защитная функция которого реализуется, главным образом, в надземных органах, а не в корневой системе.
Полиамины (ПА) - путресцин (Пут), сперми-дин (Спд), спермин (Спм) - низкомолекулярные органические соединения катионной природы. Они обладают выраженным стресс-протекторным эффектом и являются универсальными мультифункциональными регуляторами физиологических процессов [5]. Накопление Пут наблюдается, как правило, при неблагоприятных условиях, например, при засолении. Активация всего пути биосинтеза ПА с накоплением Спд и
200 г
< С
160-
120
^ л о о и и
ей
л О
О
80
40
200 160 120 80 40
-1-1-1 0
24 48 72
(б)
72 0
Время, ч
24
48
72
Рис. 3. Содержание свободных полиаминов (Пут (1), Спд (2), Спм (5)) ] 300 мМ NaQ. а - корни, б - листья.
растениях гравилата городского при действии
0
0
Спм активируется достаточно редко. Обычно у неустойчивых видов наблюдается аккумуляция Пут, а устойчивые виды чаще накапливают Спд [15].
Проведенные исследования показали, что листья и корни гравилата имели высокий конститутивный уровень Спд и Спм и низкий уровень Пут. Однако в первые сутки солевого шока содержание всех трех ПА (Пут, Спд, Спм) резко падало (рис. 3а, 36). Через 48 ч в листьях, и особенно в корнях, повышалось содержание Спм. При постепенном засолении при достижении концентрации №С1 300 мМ также наблюдали повышение содержания Спм (данные не приведены). Повышение содержания Пут в листьях в условиях шокового засоления может косвенно указывать на продолжающиеся стрессовые условия, а увеличение содержания Спм в листьях и корнях, вероятно, свидетельствует о начале процесса адаптации к неблагоприятным условиям. Снижение содержания ПА в корнях на третьи сутки эксперимента, возможно, связано с их окислением полиаминоксида-зой и диаминоксидазой. Не исключено также, что высокая концентрация ионов в клетках могла ин-гибировать ГС-ГОГАТ (глутаминсинтетазный-глутаминоксиглутаратаминотрансферазный) цикл. Следует отмет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.