БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2007, том 33, № 3, с. 324-331
УДК 577.1+547.92+542.91
ИЗУЧЕНИЕ КОНФОРМАЦИОИНОЙ ПОДВИЖНОСТИ 7а-МЕТИЛ-8а-АНАЛОГОВ СТЕРОИДНЫХ ЭСТРОГЕНОВ МЕТОДОМ ЯМР
© 2007 г. С. И. Селиванов*, А. Ю. Соловьев, С. Н. Морозкина, А. Г. Шавва
Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет, 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский просп., 26 Поступила в редакцию 15.08.2006 г. Принята к печати 27.11.2006 г.
Проведена полная идентификация сигналов в спектрах ХН- и 13С-ЯМР некоторых 7а-метил-8а- и 6-окса-8а-аналогов стероидных эстрогенов. В результате определения величин ядерных эффектов Оверхаузера и вицинальных констант установлено, что эти стероиды существуют в растворе в виде быстрого в шкале времени ЯМР конформационного равновесия, связанного с инверсией кольца В. На основе сопоставления расчетных и экспериментальных данных по оценке величин двугранных углов и межпротонных расстояний получены значения заселенностей конформеров. Показано, что данное конформационное равновесие зависит от природы атома в положении 6: для 7а-метил-6-ок-са-8а-аналогов стероидных эстрогенов наблюдается уменьшение заселенности конформера, имеющего псевдоаксиальную ориентацию 7а-метильной группы, по сравнению с 7а-метил-8а-аналогом.
Ключевые слова: стероидные эстрогены, 7а-метил-8а-аналоги, конформационный анализ; спектроскопия ЯМР, вицинальные константы, ядерный эффект Оверхаузера, быстрый конформационный обмен.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что гормональное действие эстрогенов, опосредуемое соответствующими ядерными рецепторами, в значительной степени определяется особенностями строения лиганд-рецепторных комплексов [1-5]. Компьютерное моделирование их структуры позволяет объяснить на качественном уровне сродство лигандов к рецепторам [6-13] и оценить гормональные эффекты неизвестных ранее веществ, что расширяет возможности для синтеза новых соединений с улучшенными биологическими свойствами. Для моделирования связывания модифицированных стероидных гормонов с ядерными рецепторами и другими макромолекулами желательно иметь более полную информацию о пространственной структуре и внутримолекулярной динамике представителей различных групп эстрогенов с "не природным" сочленением колец, тем более что конформации молекул в кристалле и растворе могут сильно отличаться [14].
Известно, что введение метильной группы в положение 7а аналогов эстрогенов с природным сочленением колец обычно приводит к повышению сродства к рецепторам и часто используется в синтезе новых соединений [15-18]. В ряду стероидов с иным сочленением колец (например, 8а-аналогов эстрогенов) такая модификация вызывает противоположный эффект [19].
#Автор для связи (тел.: (812) 428-4325; эл. почта: птг@ра1-oma.spbu.ru; факс: (812) 428-6939).
Моделирование структуры комплексов 8а-ана-логов стероидных эстрогенов с соответствующими а-рецепторами показывает, что соединения, содержащие метильную группу в положении 7а, могут находиться в лигандсвязывающей области рецептора в различных конформациях. Для более точного прогноза гормонального действия стероидов подобного строения необходимо исследовать их структуру и молекулярную динамику в растворе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Компьютерное моделирование структуры ряда 7а-метил-8а-аналогов стероидных эстрогенов с соответствующими а-рецепторами позволило предположить, что стероиды в комплексе с рецепторами находятся в конформации, в которой кольцо В имеет форму ванны. В проведенных ранее работах по изучению структуры таких соединений в кристалле указанная конформация не зафиксирована [20, 21]. Поэтому представлялось интересным выяснить, могут ли существовать подобные конформеры в растворе.
В данной работе представлены результаты изучения методами спектроскопии ЯМР конфор-мационной подвижности в растворе трех модельных 7а-метил-8а-аналогов стероидных эстрогенов (1)—(111). Синтез этих веществ представлен на схеме.
O
h2/nlra
O (IV)
O
O
H
(Ii)
H
1. koh 2. cro3/py
O
H
4cf
H
(i)
OAc
OAc
h2/nlra
H | H
(III)
Схема.
Хорошо известно, что использование спектроскопии ЯМР в конформационном анализе основано, прежде всего, на зависимости вицинальных констант Ун-н от двугранных углов 0Н-Н [22-27] и величины ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) от межпротонного расстояния: пЯЭО ~ (гн-н)-6 [28]. Однако в случае изучения стероидных эстрогенов определение стереоспецифичных параметров Ун-н и пЯЭО в значительной мере затруднено из-за перекрывания сигналов алифатических протонов колец В, С и Б в узкой области протонного спектра 1.0-3.0 м.д. [29]. Поэтому необходимым условием проведения конформационного анализа этих молекул является корректная идентификация сигналов всех алифатических протонов. Эта задача была решена с помощью комбинированного использования нескольких гомо- и гетеро-ядерных корреляционных методов спектроскопии ЯМР: Бдр-С08У [30, 31], 1-СШУ [32, 33], ШБ8У [34-36], ШОС [37] и СОЬОС [38].
На основании анализа мультиплетной структуры кросс-пиков в спектре БОБ-С08У, использования экспериментов по селективной развязке и данных спектров 1-С08У и ШОС (без развязки от ядер 13С) для каждого из стероидов были получены значения скалярных констант 2-Ун-н. В качестве примера на рис. 16 приведена схема скалярного связывания протонов в стероиде (I), на которой цифрами указаны величины этих констант. С помощью модифицированной карплусовской зависимости 3Ун-н = У(0Н-Н) [27], учитывающей атомную электроотрицательность в а- и в-положени-ях заместителей соответствующего этанового фрагмента, экспериментальные вицинальные
были использованы для оценки
константы
3 ^эксп
•h-H
еэксп г^
h-h . Эти
экспериментальные значения сопоставлялись с
z/чрасч 3 ,расч ч
данными расчетов этих параметров (Öh-h, ^h-h), полученных методами молекулярного моделирования РМ3 и ab initio.
С результатами расчетов были также сопоставлены экспериментальные данные по оценке
и / расч эксп ч
межпротонных расстоянии (rh-h ""—- rH-H), которые были получены с помощью калибровочного метода [28, 35, 36]. Этот метод основан на сравнении величин скоростей кросс-релаксации aij между двумя парами протонов "i" и "j", расстояние между протонами одноИ из которых считается известным и выбирается в качестве эталонного - гэт-, а расстояние между протонами для второИ пары вычисляется по формуле: rij = гэт(аэт/ау)1/6, где значения оэт- и Oy определяются как отношение интегральных интенсивностеИ соответствующих
кросс- и диагональных пиков Oy = (Sij/Sil) т^ в спектре NOESY [35, 39], полученном при времени смешивания тт. Для стероидов (I)-(III) в качестве эталонного расстояния гэт- использовалось значение 2.45 Ä между протонами Н1 и Н2.
На рис. 1в приведены фрагменты спектра NOESY (тт = 0.5 с) для стероида (I) и указаны наиболее характерные межпротонные контакты (см. кросс-пики 13-Me/1lß, 13-Me/12ß, 13-Me/15ß, 13-Ме/16ß, 7ß/11ß, 1/9а, 1/11а, 11а/12а и др.), которые на качественном уровне подтверждают соответствие ее пространственного строения наиболее устоИчивоИ расчетной (РМ3) конформации, показанной на рис. 1a. Однако количественные оценки некоторых из межпротонных расстояниИ заметно расходятся с расчетными данными. На-
Рис. 1. Преимущественная конформация (а) стероида (I), схема скалярного связывания (•) протонов в этом стероиде и фрагменты его спектра КОБ8У (в) при тт = 0.5 с (СБС^, 20°С).
Рис. 2. Конформационный обмен в 7а-метил-6-окса-8а-аналоге (I).
пример, экспериментальная оценка расстояния г7р-15р составляет 2.97 А, а его расчетная величина оказывается почти на 0.4 А больше. Это различие более чем в 2 раза превышает погрешности измерений (±0.15 А) и в условиях экстремального сужения линий (шотс < 1) и выбранном времени смешивания не может быть обусловлено эффектами спиновой диффузии [28]. Поэтому мы предположили, что стероид (I) существует в растворе в виде быстрого в шкале времени ЯМР конфор-мационного равновесия между двумя формами, которые различаются конформацией кольца В.
В основной конформации (I-A) этого стероида 7а-метильная группа находится в псевдоэкваториальном положении, а в минорной (I-B) оказывается в псевдоаксиальной ориентации (рис. 2).
В этом случае наблюдаемое пространств енное взаимодействие между протонами H7^ и H15ß отражает усредненную по времени величину (r7ß_15ß), зависящую от межпротонных расстояний в каждом из конформеров (^7ß_15ß(I-A), ^7ß_15ß(I-B)) и их заселен-ностей P(I-A) и P(I-B). При оценке заселенности минорного конформера P(I-B) были использованы рас-
(I-A)
четные значения r7 р_15р
= 3.36 Á
тт -(I-B)
и r7ß-15ß
= 2.37 Á
4I-A)
и построена графическая зависимость (r> = f(PB), с помощью которой установлено, что полученное с помощью ЯЭО эффективное расстояние (r7p_15p> = = 2.97 Á соответствует значению P(I-B) ~ 14% (рис. 3).
Независимым доказательством конформаци-онного обмена в стероиде (I) является также различие между вычисленной величиной вициналь-ной константы 3J7p_8a (11.2 Гц) и ее эксперимен- r(i-B) тальным значением (10.28 Гц), которая с высокой точностью (±0.02 Гц) была определена из мульти-плетной структуры сигнала протона Н7в (4.32 м.д.) при 20°С. Более того, при повышении температуры до 60°С наблюдалось уменьшение этой константы до 10.20 Гц. Это в явном виде свидетельствует о существовании быстрого конформацион-ного равновесия (I-A) (I-B), поскольку
уменьшение средней по времени константы (3J7p_8a> соответствует увеличению доли менее термодинамически устойчивой конформации (I-B), в которой протон Н7в является псевдоэкваториальным и, соответственно, должен иметь меньшее значение
константы Jp^a, чем в конформации (I-A), где он занимает псевдоаксиальное положение. На основании линейной зависимости наблюдаемой эффективной константы (3J7p_8a> от населенностей конформеров и с учетом расчетных значений
34ма = 11.2 Гц и 3<JIpB¡) а = 7.2 Гц для стероида (I)
при 20°С была сделана оценка соотношения населенностей: P(I-A) : Льв) = 80 : 20, которая в пределах погрешности измерений и точности расчетов совпадает с оценкой этого соотношения, полученного на основе ЯЭО.
Аналогичным образом было
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.