БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 4, с. 299-308
УДК 577.352.
ИЗУЧЕНИЕ ЛИПИДНЫХ РАФТОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ С ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫМ ОКРАШИВАНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНО
МЕЧЕННЫМИ АНТИТЕЛАМИ
© 2007 г. М. П. Крутикова, Г. И. Кротов, В. Г. Згода*, А. В. Филатов
Государственный научный центр "Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства
России", 115478 Москва, Каширское шоссе 24/2; тел./факс: (495) 1177765, электронная почта: higuanshe@yandex.ru *Институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, 119121 Москва, ул. Погодинская 10
Поступила в редакцию 29.01.2007 г.
Разработан новый подход к детекции белков, выделяемых в составе липидных рафтов с помощью гель-фильтрации. Клетки окрашивали флуоресцентно меченными антителами к исследуемому белку, лизировали в неионном детергенте и подвергали гель-фильтрации на Сефарозе 4 В. Исследуемые соединения регистрировали по флуоресценции связанных с ними антител. Окрашивание антигенов флуоресцентно меченными антителами до лизиса клеток существенно упрощает идентификацию исследуемых белков. Возможности метода продемонстрированы на примере нескольких поверхностных белков, ассоциированных с липидными рафтами конститутивно или в результате активации клеток.
Согласно жидкостно-мозаичной модели Синге-ра и Николсона, плазматическая мембрана представляется как текучий липидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие белки [1]. Несмотря на то что данная модель была предложена более 30 лет назад, она продолжает оставаться актуальной. Однако в последние годы жидкосто-мозаичная модель была дополнена теорией рафтов, которая появилась на свет как результат изучения поведения липидов в искусственных мембранах, а также исследования солюбили-зации биологических мембран в неионных детергентах [2, 3]. Липидные микродомены (раф-ты) представляют собой ограниченные участки поверхностной мембраны, состоящие из плотно-упакованных молекул сфинголипидов и холестерина, которые окружены обширными относительно жидкими фосфолипидными областями. Главным белковым компонентом липидных микродоменов являются гликозилфосфатидили-нозит-заякоренные белки. Рафты отличаются от остальной части мембраны как по своему строению, так и по функциям, которые они выполняют. Предполагают, что рафты играют немаловажную роль в различных клеточных процессах, включая многочисленные пути передачи сигнала, апоптоз, клеточную адгезию и миграцию клеток, а также в интернализации токсинов, бактерий и вирусов [4—
Сокращения: ДРМ - детергент-резистентные мембраны, FITC - изотиоцианат флуоресцеина, ПААГ - полиакрила-мидный гель, PBS - фосфатно-солевой буфер, CT - В-субъ-единица холерного токсина, GPI - гликозилфосфатидилино-зит, PMSF - фенилметилсульфонилфторид, mAb - монокло-нальное антитело.
9]. Являясь преформированными блоками актива-ционных молекул, рафты могут играть роль своеобразной "платформы", с которой запускается каскад биохимических превращений, связанных с передачей сигнала. Запускается каскад в результате связывания поверхностных рецепторов с лиган-дами, за которым следует транслокация рецептора из жидкой части мембраны в ее рафтовую составляющую.
Методы выделения рафтов основываются на их устойчивости к действию неионных детергентов, поэтому липидные микродомены также часто называют детергент-резистентными мембранами (ДРМ). Под действием неионных детергентов фос-фолипидная часть мембраны солюбилизируется, при этом липидные рафты отчасти остаются прикрепленными к нерастворимому в детергенте ци-тоскелету, а отчасти отрываются от лизирован-ных клеток и формируют крупные везикулы диаметром 110-240 нм и молекулярной массой не менее 10 МДа [10].
Наиболее распространенным методом выделения липидных микродоменов является ультрацентрифугирование лизатов клеток в градиенте плотности сахарозы [11]. Метод основан на том, что липидные рафты в отличие от многих других субклеточных компонентов обладают низкой плавучей плотностью. Данный метод позволяет получать достаточно чистую фракцию ДРМ, однако он обладает целым рядом недостатков. Во-первых, метод является многоступенчатым и трудоемким, так как требуется проводить центрифугирование в течение нескольких часов. Кроме того, для его ре-
ализации необходимо большое количество клеток (более 200 млн.).
Имеется несколько сообщений, в которых описано выделение рафтов гель-фильтрацией лизатов клеток на крупнопористых носителях [10, 12-15]. Как известно, метод гель-фильтрации основан на разделении частиц по размеру, а точнее - по радиусу Стокса. ДРМ в виде крупных везикул выходят в свободном объеме колонки, а элюция солюбили-зированных в мономерной форме белков происходит с задержкой. Белковый состав фракций, полученных как ультрацентрифугированием, так и гель-фильтрацией, как правило, анализируют методом иммуноблоттинга [10, 12]. В настоящей работе предложен метод изучения рафтов, выделяемых гель-фильтрацией, с принципиально новым подходом к детекции изучаемых антигенов. Исследуемые антигены были окрашены флуоресцентно меченными антителами до лизиса клеток, что позволило упростить процедуру идентификации белков, так как при этом опускаются трудоемкие стадии электрофореза, переноса и иммунохимическо-го проявления антигенов. Проведена оптимизация предложенного метода.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные линии человека CEM, HUT-78, IM-9, Ramos, HeLa выращивали в среде DMEM ("ICN Pharmaceuticals", США) с добавлением 10% по объему эмбриональной телячьей сыворотки ("ICN Pharmaceuticals"). MAb к антигенам CD11a, CD20, CD23, CD45, CD54, CD71, CD95, CD98 и HLADR были получены ранее в лаборатории иммунохимии Института иммунологии. Arn^CD59 антитело было любезно предоставлено В. Хорейши (V. Horejsi). Антитела метили флуоресцентными красителями Alexa488 и FITC ("Invitrogen", США) и биотинилировали, как описано ранее [16, 17]. В качестве вторичных антител, меченных FITC, были использованы F(ab)2-фрагменты овечьих антител против IgG мыши ("Sigma", США). Тритон Х-100, Brij 96, PMSF и B-субъединица холерного токсина (CT) - фирмы "Sigma".
При иммунофлуоресцентном окрашивании к осадку клеток (2 х 107), предварительно отмытых от культуральной среды раствором Хенкса (300 g, 10 мин), добавляли флуоресцентно меченные мо-ноклональные антитела в насыщающих концентрациях либо B-субъединицу холерного токсина, меченную FITC (GT-FITC). Клетки инкубировали 30 мин при комнатной температуре, затем дважды отмывали раствором Хенкса (300 g, 10 мин). Затем клетки лизировали либо сразу, либо после дополнительного связывания вторичными антителами. В последнем случае клетки дополнительно обрабатывали FITC-мечеными F(ab)2-фрагментами овечьих антител против IgG мыши (30 мин 1 мл) и дважды отмывали. Для контроля эффективности
связывания антител часть клеток перед лизисом анализировали на проточном цитометре FACScan ("Becton Dickinson Biosciences Immunocytometry Systems", США). Для каждого образца анализировали не менее 5000 событий. Полученные результаты обрабатывали с помощью программы WinMDI.
При лизисе меченые клетки суспендировали в 300 мкл холодного лизирующего буфера (20 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1% тритон Х-100, pH 8.2). В некоторых экспериментах использовали лизирующий буфер на основе Brij 96 (25 мМ трис-HCl, 140 мМ NaCl, 0.5% Brij 96, pH 7.5). Для предотвращения протеолитического расщепления в лизирующий буфер добавляли PMSF до конечной концентрации 1 мМ. Клетки лизировали в течение 30 мин при температуре 4°С, все последующие этапы выделения проводили на холоду. Для осаждения клеточных остатков суспензию центрифугировали (3000 g, 5 мин), супернатант использовали для выделения микродоменов методом гель-фильтрации.
Гель-фильтрацию проводили на Сефарозе 2 В, 4В и 6 В ("Amersham", США), а также на Сефакри-ле S300, S400 или S1000 ("Pharmacia", Швеция); объем носителя 2 мл (колонка 1 х 2.5 см). Свободный объем колонки определяли калибровкой по голубому декстрану ("Sigma", США), как правило, он составлял 700 мкл. Колонку уравновешивали холодным лизирующим буфером (он же буфер для элюции). Клеточный лизат, 200-300 мкл (см. выше), наносили на колонку, в течение 4 мин собирали первую фракцию (300 мкл). Затем наносили 300 мкл лизирующего буфера и в течение 4 мин собирали вторую фракцию и так далее; всего 10 фракций. Белки регистрировали по интенсивности флуоресценции (флуориметр "Джин", "ДНК-Технология", Россия), возбуждение при 488 и 529 нм и регистрация при 525 и 560 нм соответственно.
Хроматографические фракции подвергали электрофоретическому разделению по Лэммли в 10% ПААГ в восстанавливающих условиях [18]. Для масс-спектрометрического анализа дорожку нарезали на полоски шириной 1.5-2 мм. Отмытые и высушенные кусочки геля подвергали трипсино-лизу [19], добавляя 5-8 мкл раствора трипсина (25 нг/мкл чистого для сиквенса модифицированного трипсина ("Promega", США) в 50 мМ бикарбонате аммония). Гидролиз белков проводили при 37°C в течение ночи. Триптические пептиды экстрагировали добавлением 12-17 мкл раствора для экстракции (5% ацетонитрила ("Merck", Германия), 0.5% муравьиной кислоты в деионизованной воде для хроматографии) в течение 30 мин. Полученные пептиды анализировали масс-спектромет-рически методом ESI. Обращенно-фазовую LC-MS/MS проводили, используя нанопроточную ВЖХ-систему, соединенную с Agilent 1100 SL Se-
ries MSD Trap ("Agilent Technologies Inc.", OTA). Пептиды, полученные после трипсинолиза, разделяли, используя линейный градиент 5-80% ацето-нитрила, содержащего 0.1% муравьиной кислоты, в течение 60 мин и детектировали с помощью ионной ловушки в диапазоне от 200 до 1800 m/z. Идентификацию белков по MS/MS спектрам полученных пептидов проводили с помощью программы MASCOT (www.matrixscience.com), используя базу данных последовательностей белков человека NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ проводили, как подробно описано ранее [20]. Клетки (4 x 107) суспендировали в 1 мл PBS (pH 8.0) и окрашивали 10 мин, добавляя 100 мкл (5 мг/мл) сукцинимидного эфира родамина 6G (Синтол, Poссия). Окрашенные клетки лизировали и хроматографичес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.