ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 600-609
УДК 579.61
ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ ВИРУЛЕНТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ, АКТИВНЫХ ПРОТИВ МНОЖЕСТВЕННО-РЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ Pseudomonas aeruginosa
© 2015 г. Н. Ш. Баларджишвили, Л. И. Квачадзе, М. И. Кутателадзе, Т. Ш. Месхи, Т. К. Патаридзе, Т. А. Беришвили, Е. Ш. Тевдорадзе
Институт бактериофагии, микробиологии и вирусологии им. Г. Элиава, Тбилиси, 0160
e-mail: nana_balarj@yahoo.com Поступила в редакцию 03.04.2015 г.
Исследована чувствительность 512 свежевыделенных клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa к антимикробным препаратам 6 классов. Отобраны и генотипированы антибиотикорезистентные штаммы, против которых выделены три новых вирулентных бактериофага, относящиеся к таксономическим семействам Myoviridae и Podoviridae. Установлены параметры цикла внутриклеточного развития фагов и изучено влияние на их жизнеспособность инактивирующих факторов (температуры, рН, УФ-излучения). Определена молекулярная масса геномов фагов, проведен рестрикцион-ный анализ их ДНК и ПААГ-элекрофорез в присутствии ДДС-Na белков оболочки. Исследована эффективность посева бактериофагов на 28 генетически отдаленных антибиотикорезистентных штаммах P. aeruginosa. Установлено, что 26 из них с высокой эффективностью лизировалось одним из фагов. Определен диапазон антибактериального действие изученных фагов и их смеси на 427 полирезистентных клинических штаммов. Показано, что объединение этих фагов в одном многокомпонентном препарате усиливало их литическую активность.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, антибиотикорезистентность, бактериофаги, литическая активность, антибактериальный препарат фагов.
DOI: 10.7868/S0555109915060033
Одними из основных возбудителей внеболь-ничных и нозокомиальных инфекций являются бактериальные штаммы Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) [1, 2]. По данным Национальной сети безопастности здоровья (National Healthcare Safety Network, NHSN США) штаммы P. aeruginosa в 8.5% случаях являются причиной госпитальных инфекций [3]. Синегнойной палочке отводится ведущее место при нозокомиальной пневмонии (16.8%), мочевых (12.0%) и раневых инфекциях (8.2%) и инфекциях кровотока [4, 5]. P. aeruginosa является наиболее распространенным возбудителем инфекционных осложнений му-ковисцидоза, которые при хроническом течении заболевания способствуют образованию биопленки, резко ухудшающей функционирование легких у больных [6]. У пациентов с пониженным иммунным ответом, в число которых входят и онкологические больные, P. aeruginosa вызывает тяжелые инфекционные осложнения, нередко приводящие к смерти [4].
Широкое распространение бактериальных штаммов P. aeruginosa и их способность активно развивать устойчивость к антибиотикам нового поколения (что может быть детерминировано как
плазмидами, так и мутационными изменениями хромосом), могут стать непреодолимым препятствием при лечении инфекционных заболеваний синегнойной этиологии [7]. В связи с этим все более актуальным становиться разработка, изучение и применение новых антибактериальных средств против инфекционных заболеваний, вызванных мультирезистентными штаммами P. aeruginosa. Одним из альтернативных подходов терапии является применение препаратов специфических бактериофагов [8—21].
Первые попытки практического применения бактериофагов проведены сразу после открытия феномена бактериофагии почти 90 лет назад. В первое время лечение бактериофагами давало неоднозначные результаты и не всегда сопровождалось успехом. Основной причиной неудачной фаготерапии являлось несоответствие этиологического профиля заболевания и используемого бактериофага, а также, отсутствие типоспецифической активности препаратов фагов и стандартных единых методологических подходов к их производству [22]. Открытие антибиотиков отодвинуло на второй план применение бактериофагов с лечебной целью.
В течение многих лет применение бактериофагов не прекращалось в странах Восточной Европы и бывшего Советского Союза. Специфические препараты бактериофагов использовались как при гастроэнтеральных, так и при гнойно-воспалительных инфекциях различной этиологии [23—25]. В настоящее время во всем мире возрождается интерес к применению бактериофагов против инфекционных заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами, в том числе полирезистентными штаммами P. aeruginosa [9, 12, 14-18, 20].
Цель работы — определение чувствительности свежевыделенных клинических штаммов P. aerugi-nosa к антимикробным препаратам, выделение вирулентных бактериофагов против антибиотикоре-зистентных штаммов, изучение основных биологических свойства и параметров репродукции вирусных частиц, определение антибактериального действия трех новых бактериофагов и создание на их основе многокомпонентного препарата фагов с высокой литической активностью.
МЕТОДИКА
Штаммы P. aeruginosa. Для выделения штаммов P. aeruginosa использован клинический материал, поступающий в Институт бактериофагии, микробиологии и вирусологии им. Г. Элиава (Грузия). Первичную селекцию проводили на среде для P. aeruginosa ("Difco", США). Микробы были идентифицированы по основным таксономическим признакам: цитохромоксидазная и каталазная активность, окрашивание по Грамму, способность роста при температуре 42°С, пигментообразование. Для размножения бактериальных штаммов и культивирования бактериофагов использовали питательную среду LB ("Difco", США).
Определение чувствительности бактериальных штаммов к антибактериальным препаратам проводили диффузионным методом с использованием дисков с известной концентрацией реагента ("BBL", США). Использованы антибиотики 6 различных классов: ß-лактамы (пенициллин, карбенициллин и имипенем), аминогликозиды (стрептомицин, гентамицин и амикацин), левоми-цетины (хлорамфеникол), тетрациклины (тетрациклин), фторхинолоны: (ципрофлоксацин) и по-лимиксины (полимиксин В). Оценка результатов была проведена согласно принятым NHSN критериям: S — чувствительные культуры, I — средне-чувствительные и R — нечувствительные [3]. Множественно резистентными считали микроорганизмы, которые проявляли нечувствительность к трем и более классам антибиотиков.
Штаммы P. aeruginosa выращивали в бульоне LB до концентрации 109 кл/мл в течение 18 ч при 37°C. Клетки собирали центрифугированием при
5000 g в течение 10 мин и три раза промывали фосфатным буфером (ФБ), рН 7.2. Осадок суспендировали в ФБ, содержащем 2% SeaKem Gold-агарозы ("Fisher Scientific", США). Бактерии в агарозном геле разрушали лизоцимом при 37°С в течение 1 ч и протеиназой К при 55°С 16 ч. Агарозу с лизированными клетками последовательно промывали трис-боратным буфером (1хТББ), рН 8.3, затем HE буфером (10 мМ HEPES, 1 мМ ЭДТА), рН 8.0. Блоки агарозы, содержащие бактериальную ДНК, инкубировали с рестрикцион-ной эндонуклеазой Spei (20 единиц) в течение 16 ч при 37°С. Рестрикционные фрагменты геномной ДНК разделяли в 1%-ном агарозном геле в буфере 0.5хТББ, содержащем 50 М тиоуреазы ("Sigma", США).
Генотипирование полученных штаммов проводили с помощью гель-электрофореза хромосомной ДНК в пульсирующем электрическом поле (PFGE) [26]. Электрофорез проводили в аппарате Gene Navigator TM system ("Amersham Biosciences",США) в течение 60—120 с при 14°С и напряжении 6.0 V • cm-1. В качестве маркеров молекулярной массы ДНК использовали набор Pulse Marker, содержащий фрагменты размером 1018.5-48.5 kb ("Sigma", США). Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали с помощью камеры Kodak Gel Logic 112 ("Kodak", США) в ультрафиолетовом свете. Результаты PFGE-анализа оценивали визуально по количеству, подвижности и интенсивности фрагментов ДНК в геле [27].
Бактериофаги P. aeruginosa. Бактериофаги были выделены на антибиотикорезистентных штаммах P. aeruginosa по общепринятой методике [28]. В качестве источника фагов использовали материал из окружающей среды, в частности сточные воды.
Определение параметров одиночного цикла репродукции бактериофагов (адсорбция, латентный период и средняя урожайность на одну инфицированную клетку) проводили по стандартной методике, описанной в работе [28].
Выделение ДНК бактериофагов и рестрикци-онный анализ осуществляли по стандартным общепринятым методикам [29].
Сравнительное исследование геномов бактериофагов проводили с помощью PFGE ДНК фагов [27].
Белки оболочки бактериофагов подвергали электрофорезу в 10%-ном полиакриламидном геле ПААГ в присутствии ДДС-Na [30]. Гели окрашивали кумасси Brilliant Blue R-250 ("Pharmacia", Швеция). В качестве маркеров молекулярной массы жпользовали набор белков с низкими молекулярными массами ((LMW Calibration Kit, "Amersham", Великобритания). Морфологию ин-тактных частиц бактериофагов изучали с помо-
%
100 80 60 40 20
0
1 2 3 4 5
7 8 9 10
Рис. 1. Резистентность к антибактериальным препаратам у штаммов P. aeruginosa (%). 1 — стрептомицин; 2 — пенициллин, 3 — тетрациклин; 4 — гентами-цин; 5 — полимиксин В; 6 — карбенициллин; 7 — ци-профлоксацин; 8 — имипенем; 9 — хлорамфеникол; 10 — амикацин.
щью трансмиссионном электронной микроскопии (Jeol 100X, Япония) с применением негативного контрастирования препаратов уранилацетатом на пластинках, покрытых слоем парлодия ("Sigma", США).
Литическую активность фагов определяли по стандартной методике [28]. Суспензию фагов наносили на слой бактериальных штаммов на плотной питательной среде (spot-test). Концентрацию фагов (титр) рассчитывали по методу Грациа, стабильность лизиса бактериальных штаммов — по методу Аппельман [28].
Эффективность посева фага определялась как отношение титра на исследуемом штамме бактерий (Т) и титра того же фага на штамме-хозяине (Т0) по уравнению Е = Т/Т0, где Е — эффективность посева [28].
Для рассчета частоты образования фагоустой-чивых мутантов бактериальных штаммов на поверхности 1.5%-ного питательного агара на чашках Петри распределяли суспензию бактериофага с известным титром и наносили эмульсию жизнеспособных бактерий известной концентрации. Чашки инкубировали в течение 18 ч при 37°С и подсчитывали количество образовавшихся бактериальных колоний. Частоту мутации (а) определяли по ура
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.