ГЕНЕТИКА, 2011, том 47, № 6, с. 853-855
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.224.46.044
ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧНОСТИ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИКЛОФОСФАНА И ДИОКСИДИНА МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
© 2011 г. К. Г. Орджоникидзе1, А. М. Занадворова1, С. К. Абилев1 2
Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 119991
e-mail: ordjonikidze@vigg.ru 2Московский государственный университет, кафедра генетики, Москва, 119991 Поступила в редакцию 27.10.2010 г.
Рассматривается применение метода щелочного гель-электрофореза единичных клеток для изучения органоспецифичности генотоксического действия лекарственных препаратов на клетках четырех органов мышей. Показано, что циклофосфан повреждает ДНК во всех изученных органах (печень, легкие, селезенка и мозг), а диоксидин во всех, кроме мозга. Сделан вывод о том, что данный метод может быть использован для изучения органоспецифичности ДНК-повреждающего действия различных химических соединений.
В настоящее время основным методом оценки мутагенной активности химических соединений в экспериментах на млекопитающих является цито-генетический анализ клеток костного мозга крыс и мышей. Мутагенность является одним важных прогностических признаков канцерогенной активности химических соединений. Важное значение для прогноза канцерогенных свойств имеют результаты изучения генотоксичности химических веществ в различных органах млекопитающих.
Анализ базы данных по канцерогенной активности химических факторов среды показывает, что регистрируемые канцерогенные эффекты зависят как от вида лабораторного животного (крыса или мышь), так и от органа животных [1]. Для изучения органной специфичности генотоксиче-ского действия в настоящее время используются полиорганный микроядерный тест [2], метод щелочной элюции ДНК [3], метод гель-электрофореза одиночных клеток (метод комет) [4] и тест на трансгенных мышах [5]. Они отличаются друг от друга не только принципами методов, но регистрируемыми генетическими эффектами и надежностью. Наиболее надежным (валидным) из них является полиорганный микроядерный тест [6]. Если в микроядерном тесте учитываются индуцированные микроядра в клетках, прошедших митоз после генотоксического воздействия, то метод щелочной элюции ДНК и метод комет позволяют учитывать разрывы и другие типы повреждений ДНК, реализующиеся в разрывы в щелочных условиях.
В настоящей работе изучали органную специфичность ДНК-повреждающего действия на мышей антибактериального препарата диоксидина и
противоопухолего препарата циклофосфана с помощью метода щелочного гель-электрофореза.
Эксперимент проводили на самцах мышей линии BALB/c в возрасте 3—4 месяцев средней массой 25 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Препараты вводили однократно внутри-брюшинно. Циклофосфан в дозе 50 мг/кг (приготовлен ex tempore), диоксидин в дозе 200 мг/кг (аптечный раствор для инъекций). Контрольной группе вводили воду для инъекций. В каждой группе было по 5 мышей. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 5 ч после инъекции. Для исследования использовали следующие органы: печень, легкие, селезенку, мозг.
Степень повреждения ДНК клеток этих органов изучали в соответствии с рекомендациями [7]. Клетки иммобилизировали в 0.5%-ной теплой (37°С) легкоплавкой агарозе (для мозга — в 2%-ной). Полученную взвесь клеток наносили на подготовленный слайд (1%-ная нормоплавкая агароза на воде), затем клетки лизировали в течение 1 ч при 4°С (2.5 мМ NaCl, 100 мМ Na2EDTA, 10 мМ трис, с добавлением непосредственно в день эксперимента 10% DMSO и 1% тритон Х-100 (в % от конечного объема), pH 10). Слайды, содержащие лизат клеток, помещали в щелочной буфер (1 мМ Na2EDTA, 300 мМ NaOH, pH 13) на 20 мин для раскручивания спирали ДНК и реализации щелочелабильных сайтов в однонитевые разрывы. После этого последовательно проводили: электрофорез (0.7 В/см, 200 мА, 10 мин), нейтрализацию слайдов в нейтрализующем буфере (трис, pH 7.5), высушивание их при комнатной температуре и окраску акридиновым оранжевым. Далее слайды изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss и подсчитывали содержа-
854
ОРДЖОНИКИДЗЕ и др.
% ДНК в хвосте комет
20 г ± стандартная ошибка 18 16 14 12 10 8 6 4 2
Циклофосфан
Диоксидин
Контроль
Печень
Легкие
Мозг Селезенка
Рис. 1. ДНК-повреждающая активность циклофос-фана и диоксидина в клетках различных органов мышей.
ние ДНК в хвосте комет (в %) с помощью программы Comet score. Показатель "% ДНК в хвосте кометы" отражает количество низкомолекулярной ДНК в виде однонитевых фрагментов, образовавшихся в результате разрывов и реализации щелочелабильных участков ДНК и мигрировавших в сторону анода при электрофорезе.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Win Stat — приложения для Excel.
На рис. 1 видно, что диоксидин не вызывал повреждений в клетках мозга и проявил одинаковую ДНК-повреждающую активность в клетках всех других органов: печени, легких и селезенки (9.87, 9.37 и 10.29% ДНК в хвосте кометы соответственно против 6.13, 6.40 и 7.38% в контроле). Циклофосфан проявил более высокий уровень ДНК-повреждаюшего действия, чем диоксидин, и был
активен во всех органах, включая мозг. При этом наибольшую активность проявил в клетках легких. В качестве типичной картины, наблюдаемой при гель-электрофорезе клеток с поврежденной ДНК, на рис. 2 приведена фотография части слайда с клетками легких мышей, обработанных циклофосфаном.
Способность циклофосфана вызывать повреждения ДНК в клетках головного мозга млекопитающих нами показана впервые. По-видимому, активные метаболиты циклофосфана легко проходят через гематоэнцефалический барьер.
Диоксидин в организме не подвергается биотрансформации и выводится почти в неизменном виде [2]. Показано, что он усиливает в клетке сво-боднорадикальные процессы, приводящие к повреждениям ДНК [7]. В наших экспериментах диоксидин в одинаковой степени индуцировал повреждения в клетках печени, легких и селезенки мышей. Но не был активен в клетках мозга, в отличие от циклофосфана, хотя ранее было показана способность диоксидина проходить через ге-матоэнцефалический барьер [2].
Диоксидин как антибактериальное средство широко используется в клинической практике для лечения гнойных инфекций [8]. Он обладает мутагенной активностью и индуцирует мутации в клетках бактерий, хромосомные аберрации и микроядра в клетках костного мозга мышей [9, 10], а также доминантные летальные мутации в половых клетках самцов мышей [9]. Циклофосфан является противоопухолевым препаратом. Его цитотоксич-ность и мутагенная активность обусловлены образованием в организме млекопитающих алкилиру-ющих метаболитов, обладающих высокой реакционной способностью [11, 12].
0
Рис. 2. Клетки легких мышей, обработанных циклофосфаном (а), и контрольной группы (б).
ГЕНЕТИКА том 47 № 6 2011
ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧНОСТИ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
855
Таким образом, нами методом гель-электрофореза показана способность антибактериального средства диоксидина и противоопухолевого препарата циклофосфана индуцировать повреждения ДНК в различных органах мышей. Метод гель-электрофореза позволил количественно определить уровень ДНК-повреждений в исследованных органах и может быть использован для изучения органной специфичности генотоксиче-ского действия широкого круга химических соединений.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gold L.S. Handbook of Carcinogenic Potency and Genotoxicity Databases. Boca Raton, FL: CRC Press, 1997. 754 p.
2. Сычева Л.П. Оценка органной специфичности мутагенного эффекта циклофосфамида у мышей микроядерным методом // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2001. Т. 131. № 4. С. 445-447.
3. Swenberg J.A., Petzold G.L., Harbach P.R. In vitro DNA damage/alkaline elution assay for predicting carcinogenic potential // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1976. V. 72. I. 2. P. 732-738.
4. Oshida K., Iwanaga E., Miyamoto K., Miyamoto Y. Comet assay in murine bone-marrow cell line (FDC-P2) // Toxicology in vitro. 2010. № 3. P. 1039-1044.
5. Shelton S.D., Cherry V., Manjanatha M.G. МШяй frequency and molecular analysis of in vivo lacI mutations
in the bone marrow of Big Blue rats treated with 7, 12-dimethylbenz[a]anthracene // Environ. Mol. Мц-tagen. 2000. V. 36. № 3. P. 235-242.
6. Полиорганный микроядерный тест в эколого-ги-гиенических исследованиях / Ред. Рахманин Ю.А., Сычева Л.П. М.: Гениус, 2007. 312 с.
7. Hartmann A., AgurellE., Beevers C. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay // Ми-tagenesis. 2003. V. 18. № 1. P. 45-51.
8. Падейская Е.Н. Антибактериальный препарат ди-оксидин: особенности биологического действия и значение в терапии различных форм гнойной инфекции // Инфекции и антимикробная терапия. 2001. Т. 3. № 5. С. 150-155.
9. Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н. и др. Изучение мутагенной активности диоксиди-на // Генетика. 1985. Т. 21. № 5. С. 11-19
10. Сычева Л.П., Коваленко М.А., Шереметьева С.М. и др. Изучение мутагенного действия диоксидина полиорганным микроядерным методом // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2001. Т. 132. № 8. С. 188195.
11. Della Morte R., Belisario M.A., Farina С. et al. In vivo studies on the transformation of cyclophosphamide to mutagenic metabolites // Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1982. V. 58. № 16. P. 1061-1067.
12. Anderson D., Bishop J.B., Garner R.C. et al. Cyclophos-phamide: review of its mutagenicity for an assessment of potential germ cell risks // МШ^. Res. 1995. V. 330. № 1-2. P. 115-181.
Organ Specificity of the Genotoxic Effects of Cyclophosphane and Dioxidine:
An Alkaline Comet Assay Study
K. G. Ordzhonikidzea, A. M. Zanadvorovaa, and S. K. Abileva, b
aVavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia
e-mail: ordjonikidze@vigg.ru bMoscow State University, Moscow, 119001 Russia
The applicability of alkaline comet assay to studying the organ specificity of the genotoxic effects of drugs has been estimated using cells from four organs of mice (the liver, lungs, spleen, and brain). It has been found that
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.