МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 585-594
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА ^
УДК 578.821
ИЗУЧЕНИЕ ОРТОПОКСВИРУСИЫХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ КЕЬСИ-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ. II. СОЗДАНИЕ ВАРИАНТОВ ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ С НАПРАВЛЕННЫМИ ДЕЛЕЦИЯМИ ГЕНОВ
© 2003 г. И. В. Колосова, С. В. Серегин, Г. В. Кочнева, Е. И. Рябчикова, Е. В. Бессмельцева, И. Н. Бабкина, Т. Е. Соленова, И. В. Бабкин, С. Н. Щелкунов*
Институт молекулярной биологии, Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Колъцово, Новосибирская обл., 630559 Поступила в редакцию 24.07.2002 г.
Сконструированы интегративные плазмиды рДС, рДБ и рДО, содержащие доминантный селективный маркер вне области гомологии с вирусной ДНК, которые обеспечивают получение рекомби-нантных вирусов оспы коров с делециями генов С18Ь, Б11Ь и С3Ь, кодирующих ке1сЬ-подобные белки. Получены мутантные вирусы оспы коров с делецией генов БИЬ, С18ь, С3Ь, мутанты с делецией двух генов, ЭНЬЮЗЬ, С18ЫЪ11Ь и трех - В11ЬЮ3ЫС18Ь, т.е. без генов ке1еЬ-подобных белков, расположенных в левом вариабельном конце вирусного генома. Выявлено снижение уровня репродукции тройного мутанта вируса оспы коров. Найдены различия в морфологии и размерах оспин, индуцированных размножением мутантного вируса и исходного штамма, установлено развитие деструктивных изменений в клетках хорионаллантоисной оболочки куриных эмбрионов, отличающихся от изменений в клетках, зараженных исходным штаммом вируса.
Ключевые слова: гены семейства ке1еЬ-белков, вирус оспы коров, доминантный селективный маркер, направленный мутагенез.
Секвенирование геномов ряда штаммов вирусов натуральной оспы (ВНО), оспы обезьян (BOO), оспы коров (ВОК) и осповакцины (ВОВ), а также компьютерный анализ полученных данных позволили выявить семейство генов, гомологов гена белка kelch кольцевых канальцев дрозофилы [1, 2]. Функции белков данного семейства у поксвирусов неизвестны, однако ортопоксвиру-сы, патогенные для человека, характеризуются видоспецифичностью набора этих генов [2].
Цель данной работы - получение ВОК с направленными делециями генов семейства kelch-подобных белков и изучение свойств мутантных вирусов в различных системах in vitro и in vivo.
Выбор ВОК продиктован следующими обстоятельствами. Во-первых, ВОК так же, как и ВОВ, слабо патогенен для человека, но в отличие от него, имеет широкий круг природных хозяев, в том
Принятые сокращения: ВНО - вирус натуральной оспы, BOO - вирус оспы обезьян, ВОК - вирус оспы коров, ВОВ -вирус осповакцины, D, G, C - гены D11L, G3L, C18L ВОК, кодирующие kelch-подобньге белки, ОРТ - открытая рамка трансляции, КЭ - куриные эмбрионы, ХАО - хорионал-лантоисная оболочка, gpt - ксантин-гуанин-фосфорибо-зилтрансфераза, МРА - микофеноловая кислота, ПЦР -полимеразная цепная реакция, ПААГ - полиакриламид-ный гель, БОЕ - бляшкообразующая единица, ООЕ - ос-пинообразующая единица.
* Эл. почта: snshchel@vector.nsc.ru
числе мелких грызунов, что удобно для изучения биологических свойств в лабораторных условиях [1]. Во-вторых, в геноме ВОК обнаружены шесть генов семейства kelch-подобных белков, тогда как геном ВОВ кодирует три полноразмерных белка этого семейства, ВОО - один, в геноме ВНО часть генов этого семейства отсутствует, а оставшиеся представлены значительно укороченными рамками считывания [2-4]. В-третьих, выбранный штамм ВОК GRI-90 выделен от человека и имеет хорошо известную короткую пассажную историю [5].
В настоящей работе сконструированы реком-бинантные интегративные плазмиды, с их помощью получены варианты ВОК с делециями генов C, D, G и изучены их свойства в системе куриных эмбрионов (КЭ).
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Штаммы микроорганизмов и их культивирование. В работе использовали любезно предоставленный С.С. Маренниковой штамм GRI-90 ВОК, выделенный от человека в 1990 г. [5], перевиваемую культуру клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1 (ГНЦ ВБ "Вектор") и первичную культуру фибробластов КЭ (ФЭК) [6], 8- и 11-дневные КЭ (ГППЗ "Новосибирский", Кольцово),
штамм Escherichia coli JM109 (recAl, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rkm+), supE44, relAl, X-,
A(lac-proA, B), [F' traD96, proA, B, lacIqZAM15]), плазмиды pCB5, pCB3 и pCH226 [7].
Вирус нарабатывали на культуре клеток CV-1, используя поддерживающую среду ДМЕМ с 2%-ной эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота или на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) КЭ. Вирусную ДНК выделяли согласно [8] с небольшими модификациями. Клетки CV-1 трансфицировали плазмидной ДНК с использованием липофектина ("Gibco BRL", США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя [9]. Вирусные клоны получали из отдельных бляшек под твердым агарозным покрытием [10] и подращивали на монослое клеток CV-1.
Для количественной оценки репродукции вируса использовали клетки CV-1 и ФЭК, выращенные в пенициллиновых флаконах. Монослой клеток инфицировали с множественностью 0.005-0.01 БОЕ/клетку и инкубировали при 37°С в течение 24 и 48 ч, после чего трижды замораживали-оттаивали. Вирусную суспензию титровали методом бляшек на монослое клеток CV-1, выращенном в ше-стилуночных планшетах.
Приготовление сред, ферментативные реакции, выделение ДНК, электрофорез в ПААГ и агарозном геле, трансформацию клеток E. coli проводили согласно [11]. Рекомбинантные плазмиды получали, как описано [12], согласно [11].
Среды и реагенты. Использовали питательные среды ДМЕМ и 199 для культур клеток (ГНЦ ВБ "Вектор"), эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота (ООО "БиолоТ", Санкт-Петербург), основные компоненты питательных сред для культур микроорганизмов ("Difco", США), эндонуклеазы рестрикции, Т4-ДНК-лига-зу, Tag-ДНК-полимеразу ("СибЭнзим," Новосибирск), акриламид, агарозу, ксантин, гипоксан-тин, микофеноловую кислоту (МРА) и другие реактивы ("Sigma", США).
Олигонуклеотидные праймеры. Условия ПЦР и структуру праймеров определяли с помощью компьютерной программы OLIGO [13]. Использовали праймеры, синтезированные в НИБХ СО РАН.
Для делетирования гена C ВОК: BamHI
1. 5'-ATGAGGATCCAGATAGTTTATATCCG-3'
PspEI
2. 5'-ATGTACGGTAACCATGTAGGAAAGAT-3'
PspEI
3. 5'-ATGTAAAGGTTACCATATTCAATATTTTTT-3'
tfrndIII
4. 5'-CCCTAAAAAGCTTATGTTGTTGGA-3'.
Для делетирования гена D ВОК: BamHI
5. 5'-TCACGGATCCATCTTCTATCTGCG-3'
PspEI
6. 5'-TCGTTGGGTTACCAAGACTTTAAGATG-3'
PspEI
7. 5'-CACGATAGGTAACC ATCTAATTAATGG-3'
Hindlll
8. 5'-CAGATGAAGCTTGACTAAGATAAAATTG-3'. Для делетирования гена G ВОК:
BamHI
9. 5'-AGCGGATCC AAGTACAGGCATAT-3'
PspEI
10. 5'-ATATCGGTTACC ATGTTTCTTTAAAAGT-3'
PspEI
11. 5'-GGGATGGTAACCAATGGGATGG-3'
Hindlll
12. 5'-GGGTAAGCTTTAGATATTCACGCGTG-3'. Жирным выделены участки узнавания эндо-
нуклеаз рестрикции, названия которых указаны сверху.
Вирусные клоны с делецией гена ë выявляли с помощью ПЦР с праймерами:
13. 5'-GGAACGTCACGCTCTCCACCTT-3'
14. 5'-GGCGATCCATCCTATTATAATGATGAT-3'; гена D:
15. 5'-GGGCGTTCTAATGAAAGTAGCTTGTT-3'
16. 5'-CCCGTTATGCGTATTCCCGTTA-3'; гена G:
17. 5'-CACCGCCTCCTATATCAATGCCTTT-3'
18. 5'-CCGCACCCATGAATGTCGATAATT-3'. Праймеры 13, 15 и 17 специфичны к участкам
"левых" фрагментов, фланкирующих соответствующий ген, а праймеры 14, 16 и 18 - к участкам генома ВОК, прилегающим к "правым" фрагментам.
Получение плазмиды pUCgpt, содержащей ген gpt E. coli под контролем 7.5К-промотора ВОВ. Векторную плазмиду pUC19 [14] расщепляли рес-триктазой EcoRI, обрабатывали щелочной фос-фатазой и проводили электрофорез в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. Линеаризованную плазмиду из агарозного геля выделяли согласно [11]. Фрагмент, содержащий ген gpt E. coli под контролем промотора 7.5К ВОВ, получали из плазмиды p7.5Kgpt-env [15] в виде EcoRI-EcoRI-фрагмента (800 п.н.) [11]. Лигазной смесью (2 пмоля фрагмента и 0.4 пмоля векторной ДНК), трансформировали клетки E. coli JM109. Рекомбинантные бактериальные клоны отбирали с помощью расщепления выделенной из них плазмид-ной ДНК рестриктазой EcoRI и последующего секвенирования полученного фрагмента [16].
Получение интегративных плазмид pAC, pAD и pAG. При конструировании плазмиды pAC,
предназначенной для делетирования гена С из генома ВОК, с помощью ПЦР получали два фрагмента размером около 1 т.п.н. каждый, фланкирующие ген С справа и слева. В качестве матрицы использовали выбранную из банка клонированных фрагментов ВОК [7] плазмиду рСВ5 и прай-меры 1, 2 и 3, 4 в качестве "левой" и "правой" пары праймеров соответственно. Фрагменты дНк обрабатывали рестриктазами БатН1 и PspE\ (фланкирующий слева), PspE\ и ИтдИI (фланкирующий справа), очищали с помощью электрофореза в ПААГ и электроэлюции согласно [11] и совместно клонировали в векторе pUCgpt, обработанном рестриктазами БатН1 и ИшёШ. Рекомбинантные бактериальные клоны на первом этапе отбирали с помощью ПЦР с праймерами 1 и 4 на матрице ДНК из отдельных колоний. На втором этапе из клонов, содержащих, по данным ПЦР, фрагмент расчетной длины, выделяли плазмидную ДНК и определяли присутствие в ней БатН1-, ИшШП- и РярЕЬсайтов, а также соответствие длин полученных рестрикцион-ных фрагментов ожидаемым. В результате получили плазмиду рДС.
Плазмиды рДБ и рДв, предназначенные для конструирования вариантов ВОК с делециями генов Э и О соответственно, получали таким же способом с использованием плазмид рСВ3 и рСН226 [7] в качестве матриц и праймеров 5-8 и 9-12.
Получение клонового варианта ВОК. Исходный штамм ВОК вЯ1-90 клонировали методом бляшек на монослое клеток СУ-1 под твердым агарозным покрытием [10]. Сравнительный анализ ДНК выделенных клонов и исходного штамма ВОК вЯ1-90 проводили с использованием эн-донуклеазы рестрикции ИгиШП. Анализировали оспины, образованные выбранными клонами на ХАО 11-дневных КЭ. Патогенность отобранного клона 5 (обозначен ВОК-5) в сравнении со штаммом ВОК вЯ1-90 проверяли на 20-дневных нелинейных белых мышах, которым внутрибрюшин-но вводили разные дозы вируса.
Получение ВОК с делецией генов С, О или О.
Зараженные ВОК клетки СУ-1 трансфицировали интегративными плазмидами. Для обогащения трансфекционного пула делеционными мутантами ВОК использовали селективную среду, содержащую МРА (2.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.