ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 1, с. 119-126
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.1:595.773.4
ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕНЕЗА БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА МОДЕЛИ Drosophila melanogaster: ДЕФИЦИТ СИНАПТИЧЕСКОГО БЕЛКА СИНАПТОТАГМИНА В МОЗГЕ ТРАНСГЕННЫХ МУХ С ИЗБЫТОЧНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ АРР ЧЕЛОВЕКА
© 2009 г. С. В. Саранцева1, О. И. Большакова1, С. И. Тимошенко1, Д. И. Родин1, М. П. Витек2, A. Л. Шварцман1, 3
1 Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук, Гатчина Ленинградской обл. 188300; e-mail: svesar@omrb.pnpi.spb.ru 2Отдел неврологии, Медицинский центр Университета Дюка, Дурем, NC 27710, США; e-mail: vitek001@mc.duke.edu 3Институт экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург 197376; e-mail: aschwart1@yandex.ru Поступила в редакцию 03.05.2007 г.
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, важнейшим патоморфологическим признаком которого является дегенерация синапсов в коре и гиппокампе. Нарушение синаптогенеза предшествует амилоидозу и нейродегенерации и коррелирует с нарушением памяти в ранней клинической фазе заболевания. Мутации в гене предшественника амилоида (АРР) вызывают семейную форму БА и приводят к усилению секреции амилоид-бета-протеина (АР). Остается, однако, неясным, каким образом АРР и Ар вовлечены в нарушение синапсов в отсутствие видимых амилоидных структур. В работе исследована роль гена APP (amyloid precursor protein) человека в синаптогенезе в трансгенных линиях Drosophila melanogaster, экспрес-сирующих в нервных клетках изоформу АРР695 человека, укороченные формы белка и пресинап-тический маркер синаптотагмин, включающий последовательность зеленого флуоресцентного белка. Экспрессия АРР и его фрагментов вызывала уменьшение содержания синаптотагмина в ан-теннальных долях и грибовидных телах мозга D. melanogaster и прогрессирующую с возрастом ней-родегенерацию. Полученные результаты указывают, что нарушение синаптогенеза и нейродегене-рация могут происходить в мозге Drosophila в отсутствие Ар. Мы предполагаем, что нарушение клеточных функций АРР и секреция Ар вносят независимый вклад в патогенез БА.
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой наиболее распространенную форму первичных нейродегенеративных заболеваний пожилого возраста, которая характеризуется прогрессирующей потерей памяти, расстройством речи, распадом интеллекта и психической деятельности [1]. Подавляющее число случаев БА являются спорадическими и не носят наследственного характера. Ранние семейные формы БА характеризуются аутосомно-доминантным типом наследования и составляют лишь небольшую часть (до 15%) патологии [2]. Дегенерация синапсов в лобной и височной коре и в гиппокампе является одним из основных патоморфологических признаков БА, который строго коррелирует с развитием деменции [3-5]. Вместе с тем механизм, приводящий к дисфункции синапсов как при спорадических, так и семейных формах заболевания, остается неясным. Доминирующей гипотезой развития БА является "гипотеза амилоидного каскада", в основе которой лежит положение о том, что повышенная секреция
нейротоксичных форм амилоид-бета-протеина (АР), являющегося главным компонентом амилоидных отложений в мозге больных, обусловливает всю цепочку патологических изменений, приводящих в конечном счете к развитию деменции [6, 7]. Главными доказательствами этой гипотезы являются генетические данные о том, что семейные формы БА (СБА) обусловлены мутациями в генах белков, непосредственно участвующих в генерации АР: гена белка - предшественника Ар, получившего название АРР (amyloid precursor protein); гена пресенилина-1 (PS1) и гена пресенили-на-2 (PS2) [7]. АР представляет собой короткий пептид (39-43 аминокислоты), образующийся в результате протеолитического процессинга АРР. В протеолитический процессинг АРР вовлечены две мембранные протеазы, названные Р- и у-сек-ретазами. При этом пресенилины являются частью у-секретазного комплекса, который играет ключевую роль в процессинге АРР и генерации Ар. Третья протеаза, названная а-секретазой, которая конкурирует с Р-секретазой за субстрат
АРР, может предотвратить образование Aß, расщепляя пептид на два фрагмента [7].
В настоящее время известны более 150 случаев СБА, вызванных мутациями в гене PS1, 10 случаев СБА, обусловленных мутациями в гене PS2, и 25 мутаций СБА были найдены в гене APP (http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations).
Несмотря на широкое признание гипотезы "амилоидного каскада", первые сомнения в ее универсальном характере вызвали сообщения о том, что у больных в ранней фазе СБА нарушение памяти и дисфункция синапсов происходят в отсутствие амилоидогенеза или нейрофибрил-лярной дегенерации и предшествуют гибели нейронов [8]. Аналогичные результаты были получены и у трансгенных мышей, несущих СБА мутации в генах ÄPP и PS1 [9]. И наконец, изучение больных с СБА продемонстрировало, что мутации в PS1 и АРР не обязательно ведут к повышению тотального уровня Aß, а, напротив, могут приводить к его снижению [10-12]. При этом в ряде случаев отмечалось изменение отношения секреции Aß, содержащего 40 и 42 аминокислоты (соответственно Aß40 и Aß42) [11, 12]. Эти результаты однозначно показывают, что для ясного понимания патогенеза СБА необходимо учитывать не только изменение секреции Aß, но и возможные нарушения клеточных функций АРР и пресенилинов. В нашей работе мы исследовали роль APP в синаптогенезе, используя трансгенные линии Drosophila melanogaster, экспрессиру-ющие в нервных клетках изоформу АРР695 человека, укороченные формы белка и пресинаптиче-ский маркер синаптотагмин, включающий последовательность зеленого флуоресцентного белка (syt1-eGFP). Выбор в качестве маркера си-наптотагмина был обусловлен тем обстоятельством, что его содержание прямо коррелирует как с образованием синаптических везикул, так и с плотностью зрелых синапсов у млекопитающих и насекомых и резко падает в мозге больных со спорадической и наследственной формами БА [13-15].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии и условия содержания мух. В работе были использованы трансгенные линии Drosophila melanogaster: UAS-ApP (содержит ген АРР человека), UAS-APP-Swedish (содержит ген АРР человека с мутацией Swedish, приводящей к наследственной форме болезни Альцгеймера), UAS-APPACT, UAS-APPANT (укороченные формы АРР), elav-GAL4c155, UAS-syt-eGFP (содержит синаптотагмин-1, включающий зеленый флуоресцентный белок). Экспрессия АРР и его фрагментов была проведена в нервных тканях Drosophila с использованием тканеспецифического активатора транскрипции elav-GAL4c155. Линии были получе-
ны из коллекции Drosophila Bloomington Stock Center. Во время проведения экспериментов мух содержали на стандартной дрожжевой среде при температуре 25°С и 12-часовом световом дне. Анализ экспрессии синаптотагмина и нейродеге-нерации проводили у потомков от скрещиваний самок генотипа elav-GAL4c155,UAS-syt-eGFP и самцов линий, несущих инсерции гена АРР (APP-Swedish) и его фрагментов.
Приготовление образцов для конфокальной микроскопии. Мух помещали в фиксирующий раствор (3.38 мл 37%-ного формальдегида (Merck), 0. 5 мл 1 M Na2PO4, pH 6.8, 5 мл октана, 1.12 мл воды) на 20 мин. Далее в фосфатном буфере головы мух отделяли от тела и помещали в другой фиксирующий раствор (0.43 мл 37%-ного формальдегида (Merck), 0. 4 мл 1 M Na2PO4, pH 6.8, 3.17 мл воды) на 90 мин при 4°С. После фиксации в фосфатном буфере выделяли мозг, который помещали на стекла с углублениями в раствор фосфатный буфер-глицерин (1 : 1).
Конфокальная микроскопия и оценка интенсивности флуоресценции зеленого белка (GFP). Конфокальная микроскопия была проведена с помощью микроскопа LSM5 Pascal со встроенным 35-мВт аргонным лазером. Сканирование всех образцов проводили при одинаковых настройках сканирования. Флуоресцентный сигнал визуализировали при длине волны X 488 нм. Толщина срезов при сканировании составляла 2 мкм. Изображения и серии изображений анализировали при помощи специального программного обеспечения LSM5 Image Browser. Оценка интенсивности флуоресценции была проведена на микрофотографиях конфокальных срезов в программе Image J (version 1.38a for Windows). Обрабатывали не менее четырех образцов мозга для каждой временной точки каждой линии.
Получение и окраска парафиновых срезов головного мозга. Головы мух помещали в свежеприготовленный фиксатор Буэна на 24 ч при температуре 4°С. Далее проводили заливку объектов в парафин и приготовление парафиновых срезов толщиной 5 мкм, согласно [16]. Анализ парафиновых срезов, окрашенных гематоксилином и эозином ("Биовитрум", г. Санкт-Петербург) и заключенных в канадский бальзам, был проведен с помощью микроскопа Olympus IX71 при увеличении 12 х 20 и 12 х 40. Степень нейродегенерации оценивали с помощью световой микроскопии по количеству вакуолей на серийных срезах головного мозга при увеличении 12 х 40. Вакуоли в зависимости от размера диаметра были отнесены к трем группам: диаметром менее 10 мкм, от 10 до 20 мкм и более 20 мкм. Мухи были проанализированы в возрасте 1, 15, 30 и 45 сут. Для каждой возрастной группы во всех линиях было проанализировано по шесть серий срезов мозга.
Мембрана
Экстраклеточный домен Цитоплазматический домен
N-
N-Г
N-
-С APP
-С APP-Swedish
APPACT
-С APPANT
Рис. 1. Схематическое изображение АРР695 и его фрагментов, использованных в работе.
APP - изоформа APP695 человека; APP-Swedish - АРР695 человека с мутацией Swedish; APPACT - фрагмент АРР695 с делетированным цитоплазматическим доменом; APPANT - фрагмент АРР695 с делетированным экстраклеточным доменом. ** - местоположение аминокислотных замен, соответствующих мутации Swedish.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Центральная роль АРР в патогенезе БА была постулирована на основании многочисленных экспериментов, демонстрирующих, что изменение процессинга АРР ведет к увеличению содержания АР42, повышению скорости образования АР-олигомеров и агрегатов и сопровождается выраженными нейротоксическими эффектами как в случаях СБА, так и у трансгенных животных [7, 9, 17, 18]. Наиболее значительное повышение уровня АР42 было отмеч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.