НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 1, с. 15-26
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 577.352
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ НЕЙРОСЕКРЕТОРНЫХ ЦИТОКИНОВ НА НЕЙРОНЫ СПИННОГО МОЗГА В УСЛОВИЯХ ГЕМИСЕКЦИИ
© 2004 г. Дж. С. Саркисян12, В. А. Чавушян12, Р. М. Сулханян12, М. В. Погосян2, Ю. X. Григорян2, 3. Э. Авакян2, А. Ж. Геворкян2, 3. А. Аветисян2, A. A. Галоян1*
1Институт биохимии им. Г. Бунятяна НАН РА, Ереван 2Институт физиологии им. Л.А. Орбели НАН РА, Ереван
Изучали протекторное действие нового гипоталамического обогащенного пролином пептида PRP-1 (proline-rich peptide), продуцируемого клетками ядер гипоталамуса (N. paraventricularis и N. su-praopticus), выделенного из нейросекреторных гранул нейрогипофиза, на травму, вызванную латеральной гемисекцией спинного мозга (СМ). Проводили регистрацию импульсной активности в интернейронах и мотонейронах СМ, исследовали результаты стимуляции смешанного (N. ischiadicus), экстензорного (N. gastrocnemius) и флексорного (N. peroneus communis) нервов на уровне и ниже места перерезки на поврежденной и симметричной интактной стороне СМ и после ежедневного (с первого дня после операции) введения PRP-1 в течение 3 нед. и без него. Активность интернейронов и мотонейронов снижалась к 3-й нед. на стороне повреждения. PRP-1 повышал активность нейронов на стороне повреждения, устранял разницу между уровнями активации с обеих сторон СМ, предотвращал формирование рубца, способствовал прорастанию нервных волокон белого вещества в месте повреждения, препятствовал дегенерации нейронов, осуществляя защиту против "тканевого стресса", что подтверждается данными регистрации активности нейронов на уровне повреждения и восстановлением двигательной активности на поврежденной стороне. Полученные результаты предполагают возможность применения PRP-1 в клинической практике для предотвращения нейро-дегенерации травматического происхождения.
Ключевые слова: спинной мозг, гемисекция, обогащенного пролином пептид.
В настоящем исследовании мы использовали открытый проф. А. Галояном и сотр. гипоталами-ческий нейропептид (proline-rich peptide, PRP-1) -иммуномодулятор и нейропротектор широкого профиля действия [1].
Ранее были выявлены важные свойства PRP-1 [1, 2]: торможение проапоптотических каспаз-3 и -9; активация каспаз-2 и -6; торможение пролиферации клеток нейробластомы N2A [3]; стимуляция иммунокомпетентных клеток (Т- и В-лимфо-цитов и макрофагов); участие в биосинтезе IL-2; протекция нейронов против многих токсических продуктов, вырабатываемых в организме; мощное антимикробное и антивирусное действие [4]; стимуляция биосинтеза глиального фибриллярного кислого белка GFAP в астроцитах in vitro, подобная действию нейротрофинов BDNF и GDNF [5]; активация образования IL-1, IL-6, TNFa и регуляция миелопоеза [6]. Как было показано в предыдущих работах [7, 8], PRP-1 является универсальным соединением, предотвращающим нейродегенерацию, как острую, вызванную животными ядами (в частности змеиными), так и
*Адресат для корреспонденции: 375014 Ереван, ул. П. Севака, д. 5/1; e-mail: rubens@neuroscience.am
хроническую, связанную с травмой нервной системы.
За последние 20 лет интенсивные исследования механизмов восстановления функции поврежденного центрального нейрона у низших и высших позвоночных привели к накоплению многочисленных фактов о прорастании разъединенных аксонов через поврежденный участок, их регенерации на большом протяжении, роли активаторов и ингибиторов аксонного роста, а также ориентации по направлению к мишени [9, 10]. Два основных вопроса в этой, несомненно, важной области нейронауки продолжают оставаться во многом еще неразрешенными: 1) причины ограничения регенерации аксона в ЦНС после повреждения спинного мозга (СМ) у зрелых высших позвоночных; 2) поиск путей, способствующих регенерации и восстановлению функций СМ [9]. Острая травма нервной системы запускает ряд морфологических и метаболических процессов, направленных на протекцию против инфекционных агентов и восстановление поврежденной ткани [11-15]. Доказано участие двух механизмов в нейрональной гибели, сопровождающей повреждение: ишемического некроза в поврежденном
участке и апоптоза, индуцированного в интакт-ной соме нейронов, аксоны которых распределены в очаге повреждения [10]. Эти механизмы направлены на удаление воспаленной ткани [16, 17]. Представлены многочисленные данные о нейрог-лиальном взаимодействии в виде сложной ступенчатой реакции, прогрессивно нарастающей по мере развития патологического процесса [18]. Нейрогли-альная активация проявляется в виде стереотипного ответа в поврежденной ткани, осуществляемого посредством выработки провоспалительных цито-кинов, функциональных изменений в мозговом сосудистом эндотелии и скоплении клеток иммунной системы [18]. Поврежденные нейроны стимулируют близлежащую микроглию и астроциты [14, 19]. Интенсивно изучаются микроглиальный ответ на нейрональное повреждение или инфекцию и молекулярные механизмы, инициирующие его [18]. Активированная микроглия трансформируется в макрофаги мозга, разрушающие поврежденные клетки, патогены, останки поврежденных клеток и нервных волокон, антигены и стимулирует T-клетки [18]. Стереотипность в глиальном ответе в различных патологических условиях (при апоплексическом ударе и ишемии, нейроде-генеративных заболеваниях, прямой и непрямой аксональной травме, воспалительном процессе вследствие инфекционного или антииммунного заболевания) [15, 20-24] предполагает изменения, отражающие эволюционно "законсервированную" программу протекции и восстановления поврежденной нервной системы [18]. Наконец, активированные астроциты изменяют свою морфологию и образуют рубец, который "замуровывает" поврежденную часть мозга [18]. Представляют интерес сведения о структурных и функциональных свойствах рубца на месте повреждения и развитии методов терапевтического вмешательства для предотвращения этого барьера [25]. Актуальной остается расшифровка сигналов, ведущих к нейрональной активации, объяснение которых обеспечит направленное вмешательство в клеточный ответ в поврежденном мозге.
К настоящему времени, несмотря на развитие различных стратегий стимуляции аксонной регенерации in vivo при повреждении СМ, особое внимание уделяется трем из них: 1) связыванию антителами тормозных белков, ассоциированных с миелином, блокирующих аксонную регенерацию; 2) модулированию внутриклеточных сигналов, способствующих росту аксонов на субстрате, тормозящем его; 3) трансплантации клеток в поврежденный участок СМ для улучшения восстановления двигательной функции, обзор которых детально представлен МакКеррахер [26]. За последние несколько лет результаты модельных экспериментов на животных позволили добиться ощутимых результатов в обеспечении аксонного роста и восстановления функций СМ [27]. Иссле-
дования поврежденного СМ обеспечили условия для стимуляции регенерации аксона на большом расстоянии от места повреждения и восстановления моторной функции: 1) блокада ассоциированных с миелином тормозных белков антителами, включающая обработку ¡N-1 антителом и стимуляцию иммунного ответа к ним с помощью вакцины; 2) аксонный спраутинг и регенерация, связанные с модуляцией нейронального внутриклеточного сигнала аппликацией нейротрофинов, антагонистов ЯИо вТРазы и инозина. Наиболее успешными для стимуляции регенерации на большом расстоянии от мишени оказались применение С3-АБР-рибо-зилтрансферазы (C3-ADP-ribosyltransferase) как антагониста ИЪо вТРазы, активация аксонного роста в транспланте и восстановление двигательной активности посредством трансплантации клеток в область повреждения [26]. Тем не менее ни одно из отмеченных достижений не может быть предложено в качестве самостоятельного терапевтического средства, перспективной остается лишь их комбинация.
В настоящем исследовании на спинальных крысах, подвергнутых предварительной латеральной гемисекции СМ (за 3 нед. до регистрации нейронной активности), нами предпринята попытка использования нового гипоталамического нейрогормона РЯР-1 для исключения травматических последствий, связанных, в частности, с формированием рубца, снижением уровня электрической активности нейронов, приводящих к нарушению поведенческой двигательной активности (гемиплегии). Ранее были представлены предварительные электрофизиологические данные и результаты морфологического исследования срезов спинного мозга на уровне повреждения [7].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводились на 54 самцах крыс Вистар (200-250 г). В хронических экспериментах у 12 из них под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/б) СМ обнажали на уровне Ь2-Ь3 посредством ламинэктомии и с правой стороны на данном уровне производили латеральную гемисекцию с помощью глазного скальпеля. Окружающую мышечную ткань и кожу зашивали, животным вводили бициллин 5 и анальгин. При необходимости в первые послеоперационные дни обеспечивали принудительное мочеиспускание. Одной группе животных с гемисекцией СМ (6 крыс) ежедневно с первого послеоперационного дня на протяжении 3 нед. вводили РИР-1 (20 мкг/100 г, в/м), контрольная группа (6 крыс) получала физиологический раствор. В остром эксперименте под новокаиновой анестезией на уровнях Т2-Т3 СМ перерезали посредством ультразвукового ножа, затем крыс обездвиживали дитилином и переводили на искусственное дыхание. В люмбальной части позво-
ночника проводили ламинэктомию на уровне L3-L4 после фиксации данной области в стерео-таксическом аппарате. Стереотаксически ориентированный стеклянный микроэлектрод с кончиком 1-2 мкм, заполненный 2 М NaCl, вводили в дорсальные и вентральные рога серого вещества на поврежденной и неповрежденной сторонах СМ в сегментах L4-L5 для регистрации одиночной активности интернейронов (ИН) и мотонейронов (МН): раздражением флексорного (N. pero-neus communis - P), экстензорного (N. gastrocnemius - G) и смешанного (N. ischiadicus - I) нервов задних конечностей, с ипси (i)- и контралатераль-ной (с) стороны у интактных животных, подвергшихся гемисекции (за 3 нед. до эксперимента), без введения (контроль) и с введением PRP-1. Использованная модель т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.