ОНТОГЕНЕЗ, 2013, том 44, № б, с. 409-41б
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 575.164
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ГЕНА ERECTA2 НА РАЗВИТИЕ ПОБЕГА
ARABIDOPSIS THALIANA © 2013 г. А. Д. Солтабаева*, У. Н. Кавай-оол**, Е. В. Куприянова*, Т. А. Ежова*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119992 Москва, ул. Ленинские Горы, ГСП-1 **Тувинский государственный университет 667000 Кызыл, ул. Ленина, 36 E-mail: ekupriyanova@gmail.com Поступила в редакцию 30.05.13 г. Окончательный вариант получен 24.06.13 г.
С помощью анализа мутанта erecta2 (er2) Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. исследована роль гена ER2 в развитии растений. Показано, что мутация er2 оказывает плейотропный эффект на развитие всех органов побега — вызывает укорочение и утолщение стебля, листа, всех органов цветка, но не изменяет чувствительности к гиббереллину. Изменения морфологии органов побега связано с изменениями полярности клеток — они становятся шире и/или короче, чем у дикого типа. Установлено, что ген ER2 локализован в нижнем плече хромосомы 1 и комплементарно взаимодействует с геном ER, играющим важную роль в контроле межклеточных взаимодействий.
Ключевые слова: развитие побега, мутанты, Arabidopsis thaliana, генные взаимодействия.
DOI: 10.7868/S0475145013060116
ВВЕДЕНИЕ
Образование тканей и органов растения — результат действия многих генов, контролирующих пространственно-временные особенности пролиферации и дифференцировки клеток. Центральную роль в контроле деления и растяжения клеток междоузлий играют гены, регулирующие синтез гиббереллина (ГБ) и передачу ГБ-сигнала. Нарушение работы этих генов приводит к снижению роста побега (Sun, 2008). Важную роль в контроле развития побега играют гены семейства ERECTA, к которому относятся гены — паралоги ERECTA (ER), ERL1 (ERECTA-LIKE1) и ERL2, кодирующие рецепторные серин-треониновые про-теинкиназы. Наиболее высокий уровень экспрессии всех паралогов наблюдается в апикальной меристеме побега и активно делящихся клетках развивающихся латеральных органов (Yokoyama et al., 1998; Shpak et al., 2004). Мутации потери функции в гене ER вызывают развитие прямостоячего полу-карликового побега с укороченными междоузлиями и латеральными органами и утолщенным стеблем (Torii et al., 1996; Ежова и др., 1997; Douglas et al., 2002; Shpak et al., 2003; Torii et al., 2003).
Мутации паралогов не имеют фенотипическо-го выражения, однако их объединение с мутацией er (у двойных и тройных мутантов) приводит к су-
щественному нарушению роста побега (8Ирак et а1., 2004; 8Ирак et а1., 2003), что свидетельствует о совместном участии паралогов в контроле развития побега. Предполагается, что гены семейства ЕЯ контролируют межклеточные взаимодействия, в том числе и взаимодействия между клетками из разных тканей, что позволяет координировать процессы пролиферации и роста клеток, определяет их полярность (соотношение осей) в развивающемся растении (8Ирак et а1., 2003; иеЫёа et а1., 2012). Функция генов семейства ЕЯ необходима для нормального развития покровной ткани (Ткпе eta1., 2011), в том числе и устьичного аппарата (8Ирак et а1., 2005; Ма8^ et а1., 2005), проводящей ткани (Яа§ш et а1., 2011; Etche11s et а1., 2013), тканей тычинок (Иогё et а1., 2008).
Недавно установлено, что ген ЕЯ играет важную роль и в поддержании гомеостаза стволовых клеток побега путем ограничения уровня цитоки-нинового сигнала. У растений, которые содержат одновременно мутации по гену ЕЯ и двум другим генам семейства ЕЯ (ЕЯЕ1, ЕЯЕ2), частично дублирующим функцию ЕЯ, наблюдается усиление цитокининового сигнала и увеличение пула стволовых клеток (иеЫёа et а1., 2013). Показано также, что ген ЕЯ вовлечен в модулирование других сигнальных путей, включая ауксиновый, брасси-
Таблица 1. Особенности морфологии побега мутанта er2 и растений дикого типа
Измеряемый параметр Генотип
дикий тип er2
Высота цветоноса, см 31.1 ± 4.6 25.6 ± 4.2*
Количество розеточных листьев 6.8 ± 1.2 5.6 ± 0.5*
Длина вегетативной части, см 14.8 ± 1.8 7.8 ± 1.2***
Длина генеративной части, см 16.3 ± 5.8 17.8 ± 3.4
Количество вегетативных узлов 2.7 ± 0.5 2 ± 0.7**
Количество генеративных узлов 25.4 ± 7.9 44.8 ± 7.3***
Длина междоузлий вегетативной части побега, см 5.6 ± 1.1 2.65 ± 0.5**
Длина междоузлий генеративной части побега, мм 6.1 ± 0.9 3.9 ± 0.7***
Примечание. В табл. 1 и 2 представлены средние величины и их стандартные отклонения; *, **, *** — средние величины мутанта ву2 достоверно отличаются от показателей растений дикого типа при уровнях значимости Р > 0.95, Р > 0.99, Р > 0.999, соответственно.
ностероидный и гиббереллиновый (van Zanten etal., 2009).
В коллекции A. thaliana кафедры генетики МГУ есть мутант erecta2 (er2), который характеризуется прямостоячим (эректоидным) стеблем, как и ранее описанные неаллельные мутанты по гену ER. Мутация получена с помощью химического мутагенеза (этилметансульфонат) из расы Dijon-M и характеризуется рецессивным моногенным характером наследования, однако детальные исследования ее фенотипического проявления пока не проводились. Основной задачей работы было изучение особенностей развития мутанта er2 для выяснения роли гена ER2 в контроле развития побега. Исследовались также локализация гена ER2 и его взаимодействие с геном ER.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использован мутанты A. thaliana er2 (линия М-21-2) и er1 (линия К-158), полученные из расы Dijon-М (линия К-1) из коллекции кафедры генетики МГУ. Растения выращивали в условиях теплицы. Для картирования мутант er2 скрещивали с мутантом clv1 (линия К-205), маркерной линией К-310 и другими маркерными линиями. Морфометрические измерения проводили на 10—20 растениях дикого типа, одиночных и двойных мутантов. Подготовку материала для сканирующей электронной микроскопии проводили как описано ранее (Ондар и др., 2008).
Для оценки чувствительности к экзогенному гиббереллину растения, начиная со стадии 4-х лист-ной розетки, опрыскивали раствором гибберел-ловой кислоты ГА3 в дозе 50 мкМ или водой каждый день в течение месяца.
Картирование осуществляли с использованием морфологических и ДНК-маркеров. Для выявления ДНК-полиморфизма в F2 от скрещивания er2 с линией К-310 использовали CAPS—маркеры, выявляющие рестрикционный полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК. Последовательности праймеров подбирали при помощи программы "Web Primer": CAPS-ADH (F 5'-CGGACAGATTATTCGATGCAA-3', R 5'-CATG-GTGATGATGCAACGAA-3'; рестрикцию амплифицированных фрагментов осуществляли с использованием эндонуклеазы XbaI) и CAPS-G17311 (F 5'-TGCGTAGATCCACTGACTTGT-3', R 5'-AGC-GGCAGACTCAGCATTGA-3', использовали эн-донуклеазу HpalI). Выделение ДНК, электрофорез в агарозном геле и рестрикцию проводили как описано в работе Ежовой с соавт. (2003). В работе были использованы праймеры и реактивы для ПЦР фирмы "Евроген" (Россия). Использовали эндонуклеазы рестрикции фирмы "СибЭнзим" (Россия). Программа для проведения ПЦР для CAPS-маркеров: 92°C - 2 мин 30 с; 92°C - 50 с; 52-55°C - 30 с; 72°C - 120 с (30 циклов); 72°C -5 мин. Расстояние от гена ER2 до ДНК-маркера оценивали по методу Koornneef, Stam (1987).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Морфологические особенности мутанта erecta2
Мутант er2 имеет ряд морфологических изменений, которые выявляются уже на стадии раннего проростка. Характерной особенностью проростков на стадии семядолей является утолщение и укорочение гипокотиля и главного корня по сравнению с диким типом (раса Dijon-M), что отличает мутант er2 и от мутанта er. Листья розетки
Рис. 1. Особенности морфологии мутанта ег2. а, б — отрезки вегетативного (а) и генеративного (б) междоузлия мутанта ег2 (слева) и дикого типа (справа): а, б — внешний вид междоузлий; в—е — поперечные срезы вегетативных междоузлий (г — дикий тип, в — ег2) и генеративных междоузлий (е — дикий тип, д — ег2); ж—и — зрелые цветки (ж), органы цветка (з) и стручки (и) мутанта ег2 (слева) и дикого типа (справа); к — эпидермальные клетки цветоноса (слева), чашелистика (в центре) и нижней стороны розеточного листа (справа) мутанта ег2 (верхний ряд) и растений дикого типа (нижний ряд).
у мутанта ег2 отличаются от розеточных листьев растений дикого типа более округлой формой и существенным уменьшением площади листовой пластинки за счет ее укорочения. У мутанта обнаружено также незначительное снижение числа листьев в розетке (табл. 1). Как правило, число листьев в розетке негативно коррелирует с временем зацветания. В случае мутанта ег2 такой корреляции мы не выявили — по времени зацветания он отставал от дикого типа на 5—7 дней.
Цветонос у мутанта эректоидного типа (прямостоячий), что отражено в названии мутанта. Высота цветоноса у мутанта ниже, чем у дикого типа (табл. 1), что связано с уменьшением длины вегетативных и генеративных междоузлий. В то же время, число генеративных узлов на цветоносе мутанта достоверно выше, чем у дикого типа
(табл. 1). Это объясняет причину того, что при ~2-х кратном уменьшении длины междоузлий общая высота стебля мутанта уменьшена лишь на 20% по сравнению с диким типом.
Эректоидность стебля мутанта связана не только с укорочением междоузлий, но и с их утолщением, что характерно как для вегетативных, так и для генеративных междоузлий (рис. 1а—1е).
У мутанта ег2 наблюдается изменение морфологии цветка (рис. 1ж). Эти изменения видны уже на молодых бутонах, которые всегда открыты, в отличие от закрытых бутонов дикого типа. Эта особенность связана с существенным укорочением и расширением чашелистиков у мутанта. Укорачиваются и утолщаются и все остальные органы цветка (рис. 1з), хотя тип органов цветка мутанта не изменяется. Стручки мутанта также в 1.5 раза
Таблица 2. Размер (мкм) эпидермальных клеток мутанта er2 и растений дикого типа
Измеряемый параметр Генотип
дикий тип гт2
Длина эпидермальных клеток стебля Ширина эпидермальных клеток стебля Длина эпидермальных больших клеток чашелистика Ширина эпидермальных больших клеток чашелистика Длина эпидермальных малых клеток чашелистика Ширина эпидермальных малых клеток чашелистика 195.9 ± 50.7 13.2 ± 3.0 147.5 ± 69.2 16.2 ± 4.9 34.8 ± 9.8 13.1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.