ГЕНЕТИКА, 2006, том 42, № 2, с. 210-218
^=ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^^^
РАСТЕНИЙ
УДК 576.382.7.:633.41
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ, ТИПА ЭКСПЛАНТА И ГЕНОТИПА НА ЧАСТОТУ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (Beta vulgaris L.) in vitro
© 2006 г. Я. В. Мишуткина, А. К. Гапоненко
Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва 117312; факс: (495) 135-05-71; e-mail: alexg@biengi.ac.ru
Поступила в редакцию 30.05.2005 г.
Оптимизирован процесс регенерации побегов in vitro для семи различных линий и сортов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) российской селекции. В зависимости от типа экспланта, состава питательной среды и генотипа частота регенерации проростков из соматических клеток и тканей сахарной свеклы составила от 10 до 97%. Проведено изучение регенерационного потенциала растений in vitro у исследованных генотипов. Определено влияние состава среды (фитогормонов и углеводов) и генотипа на частоту образования морфогенного каллуса, компетентного к регенерации растений. Проведена оценка влияния типа и концентрации различных цитокининов (зеатина, кинетина и 6-бензиламинопурина) на прямую регенерацию побегов из семядольных узлов. Оптимизирован состав среды для индукции прямой регенерации побегов из черешков листа. Изучено влияние различных концентраций абсцизовой кислоты на частоту регенерации проростков из морфогенного каллуса. Для получения эксплантов черешков листа и размножения побегов, полученных путем прямой регенерации из семядольного узла, черешков листа и каллуса, было использовано микроклональ-ное размножение. Оптимизированные способы регенерации побегов пригодны как для агробакте-риальной, так и для биобаллистической генетической трансформации исследованных генотипов сахарной свеклы.
Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) является наиболее важной культурой для производства сахара в Европе и зонах мира с умеренным климатом. В Российской Федерации за последние 10 лет использование сахарной свеклы для производства сахара резко уменьшилось вследствие использования в качестве сырья (до 70%) импортного сахара-сырца, полученного из сахарного тростника. Уменьшение доли сахарной свеклы в производстве сахара отчасти обусловлено резким падением урожайности сахарной свеклы в стране. Падение урожайности вызывается биотическими (сорные растения, насекомые-вредители, фитопатоген-ные микроорганизмы) и абиотическими (низкие температуры, засуха и засоление почв) стрессами, которым современные сорта отечественной селекции не могут противостоять.
Получение растений сахарной свеклы с улучшенными признаками путем классической генетики и селекции - технологически сложный процесс, так как сахарная свекла является перекрестноопыляющимся двулетником и требуется более восьми обратных скрещиваний для закрепления нужного признака. В настоящее время во всем мире широко используются новые технологии улучшения сельскохозяйственных культур, в ча-
стности генетическая инженерия растений. Генетическая трансформация позволяет вводить гены, определяющие устойчивость растений к стрессам или кодирующие новые ценные признаки продуктивности и качества.
Возможность управлять in vitro морфогенезом клеток и тканей растений вплоть до регенерации целого растения - необходимое условие для генетической трансформации. Получение высокой частоты регенерации растений in vitro у наиболее ценных линий и сортов необходимо для того, чтобы иметь возможность приступить к генетической модификации ценных генотипов посредством агробактериальной или биобаллистической трансформации, с целью введения ценных генов.
Первые эксперименты с культурой ткани сахарной свеклы in vitro начали проводить более 30 лет назад [1]. В 70-х годах прошлого столетия была описана индукция образования каллуса на корнях сахарной свеклы [1-3] с единичными случаями регенерации из каллуса. Позднее каллусооб-разование с различной частотой регенерации было показано на семядолях, гипокотилях и листьях сахарной свеклы [4-6]. Для отработки методик получения растений сахарной свеклы путем прямой регенерации, минуя стадию каллуса, ис-
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ Таблица 1. Состав сред для культивирования клеток и тканей сахарной свеклы in vitro
Состав среды
Варианты сред для культивирования
3
10
11
12
13
14
МБ макро- и микросоли Витамины В5 БАП, мг/л Кинетин, мг/л Зеатин, мг/л НУК, мг/л ТИБК, мг/л АБК, мг/л Сахароза, г/л Фруктоза, г/л Глюкоза, г/л
+ +
1
+ +
0.25
+ +
0.5
+ +
1
+ +
0.5
+ +
0.5
+ +
1
+ +
1
+ +
1
+ +
1
+ +
+ +
+ +
+ +
0.25
0.5
0.25
0.1
0.1
0.5
30
30
30
30
30
10 10 10
0.5 30
1
30
2 30
4 30
30
30
30
30
30
30
Примечание. НУК - 1-нафтил-уксусная кислота, БАП - 6-бензиламинопурин, ТИБК - 2,3,5-трийодбензойная кислота, АБК - абсцизовая кислота.
1
пользовались различные типы эксплантов, содержащие меристематические клетки, компетентные к регенерации побегов in vitro [7-12]. В этих работах исследовалась прямая регенерация побегов из черешков листа [7-9], семядолей [10], листьев [8], семядольных узлов [11] и тонкого эпико-тиль-образующего слоя [12]. Полученная частота регенерации сильно варьировала во всех цитируемых работах в зависимости от типа используемого экспланта, генотипа и состава питательных сред, однако все авторы отмечают низкую компетентность к регенерации растений из клеток и тканей сахарной свеклы in vitro.
Таким образом, несмотря на огромную экономическую значимость и широкие исследования в области морфогенеза, генетическая инженерия сахарной свеклы тормозится в первую очередь из-за отсутствия воспроизводимых систем регенерации растений in vitro для наиболее ценных генотипов. Создание растений свеклы с новыми сельскохозяйственными признаками (устойчивость к гербицидам, пестицидам, заболеваниям, высокая сахаристость и т.д.) остается трудной задачей.
Цель нашего исследования - оптимизировать процесс регенерации побегов in vitro для семи различных линий и сортов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) российской селекции. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:
1. Определить для каждого из исследуемых генотипов оптимальную комбинацию различных
сахаров, ростовых регуляторов и их концентрацию, необходимую для высокой частоты индукции морфогенного каллуса и регенерации из него побегов.
2. Исследовать для каждого из использованных генотипов влияние типа экспланта, различных фитогормонов и их концентрации на прямую регенерацию побегов из черешков листа и семядольных узлов.
3. Оценить влияние генотипа растения на процесс каллусообразования и регенерацию побегов из морфогенного каллуса и на прямую регенерацию побегов из черешков листа и семядольных узлов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе использовались семена следующих генотипов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.): сорта (популяции) -Льговская односемянная 52 и Рамонская односемянная 47; МС-линии - Черноземец, РМС73 и Русь, а также О-тип-линии - ЛБО17 и ЛБО19. (В данном исследовании сорта и линии условно называются генотипами.)
Состав сред и условия культивирования. Растительный материал культивировался при температурах в диапазоне от 22 до 30°С, культивирование проводили либо в темноте, либо на свету, с 16-часовым фотопериодом (16/8 - день/ночь). Для освещения использовали лампы Osram
Рис. 1. Этапы ведения культуры сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) in vitro. а - проростки; б - каллусообразование на гипокотилях; в - регенерация побегов из каллуса; г - регенерация побегов из черешков листа; д - регенерация побегов из семядольного узла; е - микроклональное размножение листьев.
L36/77 FLUORA и F36W/33 Cool White. В состав всех питательных сред входили макро- и микросоли MS [13], витамины В5 [14], фитогормоны и углеводы (табл. 1). рН среды доводили до 5.8 перед автоклавированием. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при давлении 1.2 атм в течение 15 мин.
Получение стерильного растительного материала. Для синхронизации всхожести семена выдерживали при 4-6°С в течение двух недель. Для стерилизации использовали модифицированную методику Кренса с соавт. [11]. Семена сахарной свеклы помещали в концентрированную серную кислоту на 50-60 мин, промывали 15 мин в горячей дистиллированной воде (50-60°С), содержащей 3-4 капли твин-20, и далее промывали стерильной дистиллированной водой. Затем семена помещали на 20 мин в 40%-ный раствор коммерческого отбеливателя "Белизна". После этого семена промывали стерильной водой пять раз.
Стерильные семена высаживали в пробирки, содержащие среду № 1 (табл. 1), и проращивали
в темноте при температуре 22-25°С в течение 34 нед.
Изоляция сегментов гипокотиля и индукция морфогенного каллуса из сегментов гипокотиля in vitro. Проростки (рис. 1,а) помещали в чашку Петри и скальпелем отсекали апекс побега с семядолями, оставляя нижележащую область гипокотиля длиной 10-12 мм, по одному сегменту от каждого проростка. Сегменты гипокотиля помещали в чашки Петри, содержащие среды № 3, 5 и 6 (табл. 1), по 10 сегментов на чашку. Гипокотили культивировали при 30°С в темноте в течение 58 нед для индукции каллусообразования.
Регенерация проростков из морфогенного каллуса. Регенерацию проростков из морфогенного каллуса проводили на средах № 3, 7-10 (табл. 1). В каждую чашку помещали по 20 экс-плантов морфогенного каллуса размером 2-3 мм и инкубировали при люминесцентном освещении и температуре 24°С в течение 8-12 нед.
Изоляция семядольных узлов и индукция побегообразования. Проростки помещали в чашку
Петри и скальпелем отсекали апекс побега с семядолями, оставляя нижележащую область гипо-котиля длиной 1.5-2 мм, использовали по одному сегменту от каждого проростка. Сегменты помещали в чашки Петри, содержащие среды № 2-4 и 11-16 для индукции регенерации (табл. 1). Экс-планты культивировали при люминесцентном освещении в течение 14-20 дней при температуре 24°С.
Изоляция черешков листа и индукция побегообразования. Проростки помещали в чашку Петри и скальпелем отсекали корешок с частью ги-покотиля. Апекс с семядолями и гипокотилем длиной 4-5 мм помещали в контейнеры, содержащие ср
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.