НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 4, с. 287-292
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.152.3
К КАКОМУ ТИПУ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ПРИНАДЛЕЖАТ ФЕРМЕНТЫ НЕРВНОЙ ТКАНИ И ГЕМОЛИМФЫ НЕКОТОРЫХ ОКЕАНИЧЕСКИХ МОЛЛЮСКОВ © 2012 г. Е. В. Розенгарт*, Н. Е. Басова, В. С. Сааков
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия
Методом субстратно-ингибиторного анализа показана гомогенность препаратов холинэстеразы зрительных ганглиев особей дальневосточных кальмаров — тихоокеанского Todarodespacificus и командорского Berryteuthis magister, а также гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска неп-тунеи Neptunea eulimata. В результате исследования субстратной специфичности с использованием холиновых и индофениловых эфиров и ингибиторной специфичности на основании тестирования фосфорорганических эффекторов различной структуры сделан вывод о принадлежности фермента гемолимфы нептунеи к типу ацетилхолин ацетилгидролаз (КФ 3.1.1.7), в то время, как своеобразие энзимологических характеристик холинэстераз кальмаров позволяет отнести их к типу ацилхолин ацилгидролаз (КФ 3.1.1.8).
Ключевые слова: холинэстеразы океанических моллюсков, субстратная и ингибиторная специфичность, холиновые субстраты, фосфорорганические ингибиторы.
ВВЕДЕНИЕ
В классификации ферментов для представителей семейства холинэстераз (ХЭ) выделены две номинации [1]: КФ 3.1.1.7, ацетилхолин ацетил-гидролаза (АХЭ), и КФ 3.1.1.8, ацилхолин ацил-гидролаза. Только АХЭ имеет четко определенную медиатор-гидролизующую физиологическую функцию [2, 3]. В достаточной мере условно в энзимологии ХЭ существуют два "реперных" фермента, являющихся представителями двух номинаций — это АХЭ эритроцитов человека и ХЭ (ее чаще называют бутирил-ХЭ, БХЭ) сыворотки крови лошади. Основные сравнения между ферментами проводят по параметрам реакционной способности, т.е. субстратной и ингибиторной специфичности [2, 3]. Недавно показаны достаточно существенные различия между близкородственными препаратами АХЭ млекопитающих по параметрам ингибиторной специфичности относительно чувствительности к группе изомерных хинолизидиновых фосфорорганических ингибиторов (ФОИ) [4].
Однако принадлежность препаратов ХЭ к той или иной номинации классификации ферментов [1], как правило, ограничивается ферментами млекопитающих [2, 3]. Обратились к представителям гидробионтов и провели сравнительное исследование реакционной способности ХЭ нервной ткани и гемолимфы некоторых океанических
*Адресат для корреспонденции: 194223 Санкт-Петербург, пр.Тореза, 44, тел.: (812) 552-31-88, e-mail: roz@iephb.ru.
моллюсков, имеющих общий ареал обитания в северо-западной акватории Тихого океана. Изучены препараты ХЭ ткани зрительных (оптических) ганглиев особей двух промысловых видов дальневосточных кальмаров — тихоокеанского Todarodes pacificus и командорского Berryteuthis magister, причем первый (T.pacificus) отличался значительно большей подвижностью, чем второй [5, 6]. Кроме этого, изучен препарат ХЭ гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска нептунеи Neptunea eulimata [7], который, будучи водорастворимым ферментным препаратом, дает больше оснований для сравнения с "реперными" частично очищенными препаратами АХЭ и БХЭ крови млекопитающих.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Источниками ферментов кальмаров служили центрифугат (800 g, 15 мин) водного гомогената (3 мг/мл) ткани зрительных ганглиев половозрелых особей обоего пола тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus, выловленных в северо-западной акватории Тихого океана [5], а также командорского (берингоморского) кальмара Berryteuthis magister из разных зон ареала обитания в Беринговом и Охотском морях [6]. Особей тихоокеанского брюхоногого моллюска Neptunea eulimata вылавливали в акватории залива Петра Великого Японского моря. Гемолимфу собирали, разбив раковину и сделав надрез сосуда, замораживали
при —18°, транспортировали в замороженном виде и хранили в морозильнике [7].
В качестве источников "реперных" ферментов были исследованы частично очищенные препараты АХЭ эритроцитов человека Homo sapiens и БХЭ сыворотки крови лошади Equus caballus [2, 3].
В качестве субстратов использованы коммерческие препараты иодидов ацетилхолина, бути-рилхолина и ацетил-Р-метилхолина ("Che-mapol"), а также синтезированные в лаборатории [7, 8] индофенилацетат (ИФА)
CH3C(O)O—^—^^^ /^Р и 2,6-дихлор-фенолиндофенилацетат (ДИФА)
Cl
Ферментативную активность в случае холино-вых субстратов исследовали методом продолжительного потенциометрического титрования [2]. Ферментативный гидролиз хромогенных субстратов (ИФА и ДИФА) исследован с помощью фотометрического метода [7, 8]. После проверки влияния природы буфера был использован 0.05 М фосфатный буфер рН 8.5. В качестве растворителя для ИФА и ДИФА применяли метанол, количество которого в пробе не превышало 3%. В связи с тем, что продукты ферментативного гидролиза ИФА и ДИФА—индофенол и дихлориндофенол — окрашены только в диссоциированном состоянии (рКа равны соответственно 8.1 и 5.8 [9]), в опытах с ИФА для "проявления окраски" в пробу после окончания реакции добавляли 0.07 М фос-
фатный буфер рН 11.2 с таким расчетом, чтобы рН смеси был 9.5 [7]. Измерение оптической плотности проводили методом дифференциального фотометрирования. Для этого кювета сравнения заполнялась не водой, а той же реакционной смесью, что и кювета измерения, но ХЭ при этом была полностью угнетена высокоэффективным ФОИ (соед. 2, табл. 3), что делало возможным измерение скорости ферментативной реакции на фоне спонтанного и возможного неферментативного ("белкового") гидролиза субстрата [7].
В качестве ФОИ (формулы приведены в табл. 3) исследованы диизопропилфторфосфат (соед. 1) ("Sigma"), а также ФОИ (соед. 2—7), синтезированные в Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН [2, 3].
Антихолинэстеразную эффективность ФОИ оценивали по величине бимолекулярной константы скорости взаимодействия фермента с ингибитором kjj [2, 3].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проверка гомогенности холинэстеразной активности — важный начальный этап сравнительных энзимологических исследований [2, 3, 10]. Для этой цели наиболее адекватен метод суб-стратно-ингибиторного анализа, при котором используются несколько специфических субстратов и специфических ФОИ для каждой из "реперных" ХЭ [10]. В табл. 1 приведены результаты исследования препаратов ХЭ ткани зрительных ганглиев кальмаров T. pacificus и B.magister и гемолимфы нептунеи N. eulimata. В каждом случае использованы наборы из трех субстратов и двух ФОИ различной структуры: специфические субстраты и ингибитор БХЭ [2, 3] — бутирилхолин,
Таблица 1. Проверка методом субстратно-ингибиторного анализа гомогенности активности препаратов ХЭ океанических моллюсков
Вид животного (ткань) Субстраты ФОИ (lg kii)
Соед. 1 Соед. 2
Тихоокеанский кальмар Todarodes pacificus (зрительные ганглии) Ацетилхолин 6.84 7.64
Бутирилхолин 6.86 7.56
Ацетил - ß -метилхолин 6.89 7.50
Командорский кальмар Berryteuthis magister (зрительные ганглии) Ацетилхолин 7.08 7.20
Бутирилхолин 7.08 7.15
Ацетил - ß -метилхолин 7.04 7.15
Тихоокеанский брюхоногий моллюск непту-нея Neptunea eulimata (гемолимфа) Ацетилхолин 3.24 8.33
Бутирилхолин 3.28 8.30
Индофенилацетат 3.34 8.23
Примечание. Формулы ФОИ см. в табл. 3.
К КАКОМУ ТИПУ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ПРИНАДЛЕЖАТ ФЕРМЕНТЫ
289
Таблица 2. Параметры ферментативного гидролиза разных субстратов под действием холинэстераз некоторых океанических моллюсков и млекопитающих
Вид животного (ткань) Параметры Субстраты
Ацтил-холин Бутрил-холин Ацетил-ß-метил-холин Индофенил ацетат 2,6-дихлорфе-нил-индофе-нил ацетат
Тихоокеанский кальмар Todarodes pacificus (зрительные ганглии) lgac 5.04 4.86 4.97 3.32 4.00
lg(ac/KM> 9.39 8.97 7.89 7.00 7.63
Командорский кальмар Berryteuthis magister (зрительные ганглии) lgac 4.67 4.45 4.45 - -
lg(ac/KM) 8.67 8.55 6.97 - -
Тихоокеанский брюхоногий моллюск нептунея Neptunea eulimata (гемолимфа) lgac 5.04 НО 4.97 4.43 4.40
lg(ac/KM) 9.39 - 7.89 8.30 8.63
Ацетилхолинэстераза эритроцитов быка [11] lgac 5.49 НО 5.03 - -
lg(ac/KM) 9.33 - 7.93 - -
Ацетилхолинэстераза мозга быка [11] lgac 5.46 НО 4.90 - -
lg(ac/KM) 9.25 - 7.75 - -
Ацетилхолинэстераза эритроцитов крови человека lg ac 5.58 НО 5.00 4.32 4.60
lg(ac/KM) 9.40 - 7.92 7.95 8.35
Бутирилхолинэстераза сыворотки крови лошади lgac 4.81 5.25 3.51 3.48 3.95
lg(ac/KM) 7.77 8.25 6.43 6.78 7.78
Примечание. Кинетические параметры субстратной специфичности — логарифм величины активности каталитического центра (1яас); логарифм бимолекулярной константы скорости ферментативного гидролиза [1в(ас/Км)]; НО — не определяемый — при данных экспериментальных условиях скорость гидролиза измерить не представляется возможным.
индофенилацетат и диизопропилфторфосфат (соед. 1) и специфические субстрат и ингибитор АХЭ [2, 3] — ацетил-Р-метилхолин и сульфоние-вый ФОИ (соед. 2). Как видно из табл. 1 эффективность (lg kjj) каждого из изученных ФОИ по отношению к препаратам ХЭ практически не зависела от природы субстрата, что служит достаточно убедительным свидетельством гомогенности холинэстеразной активности или, другими словами, каждый из изученных препаратов ХЭ содержит только один фермент [10].
В табл. 2 сопоставлены параметры ферментативного гидролиза разных субстратов под действием ХЭ океанических моллюсков, "реперных" млекопитающих, а также данные для АХЭ эритроцитов и мозга быка [11]. Для сравнения были взяты две группы субстратов — классические хо-линовые ацилаты (ацетилхолин, бутирилхолин и ацетил-Р-метилхолин) и хромогенные гидрофобные индофениловые эфиры (индофенилацетат и 2,6-дихлорфенолиндофенилацетат), раннее изу-
ченные в прикладных целях для повышения чувствительности метода определения холинэстераз-ной активности [7, 8, 12, 13]. В качестве кинетических параметров субстратного гидролиза использовались количественные параметры величин активности каталитического центра ХЭ (ас), характеризующие скорость ферментативной реакции
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.