ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 94, № 9, с. 1108-1113
МЕТОДИКА ЗООЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
УДК 595.771:574.21
К МЕТОДИКЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛИЧИНОК CHIRONOMUS DILUTUS (DIPTERA, CHIRONOMIDAE) НА БАКТОАГАРЕ
© 2015 г. В. В. Большаков
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, Борок, Ярославская обл., 152742, Россия
e-mail: victorb@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 12.05.2014 г.
Следуя стандартной методике, в лабораторных условиях личинок хирономид выращивают на смеси кварцевого песка и глины, цвет которых не позволяет вести наблюдение за поведением личинок, поскольку они сливаются со средой. Исследователь лишь фиксирует итоги эксперимента. Приведена новая методика содержания личинок хирономид на бактоагаре. На примере личинок Chironomus dilutus показана возможность наблюдения за отдельными особями в течение всего времени их развития. При этом бактоагар в качестве среды обусловливает увеличение продолжительности жизненного цикла.
Ключевые слова: мотыль, хирономиды, бактоагар, методика, Chironomus, Díptera
Б01: 10.7868/80044513415090056
Одним из основных объектов при исследовании водных экосистем являются хирономиды (Э1р1ега, СИкопотёае). В методиках, уже ставших классическими, именно личинок хирономид чаще других гидробионтов предложено использовать в качестве биоиндикаторов, чутко реагирующих на перемены в окружающей среде (Балушки-на, 1976; 8ж&ег, 1979; Зинченко, 2005; Истомина и др., 2008; е! а1., 2013 и др.). Личинки хирономид — один из важнейших компонентов водных экосистем; плотность популяций некоторых видов достигает десятков тысяч особей на 1 м2 (8око1оуа е! а1., 1992). Важна их роль и в самоочищении водоемов; благодаря строительству трубок-домиков в несколько раз увеличивается площадь раздела фаз вода—грунт (Шобанов, 1986), что в свою очередь способствует окислению органических остатков (ОгапеИ, 1979) и высвобождению аммиака, железа и фосфора из донных отложений (Та1га1, 1986; Lewandowski, 2007).
Взрослые хирономиды живут всего несколько дней, в течение которых происходит роение и спаривание (Белянина и др., 1983). Многие виды хирономид образуют рои на значительной высоте, в отдельных случаях до 15 м и более, что затрудняет их содержание в лабораторных условиях. В качестве объектов культивирования выступают личинки лишь некоторых видов хирономид рода СЫгопошт. С. прапш (Meigen 1804) (МюЬаПоуа е! а1., 2000), С. сШШш (8ИоЪапоу 1999) (ШЕРЛ, 2000), С. 1еШат (РаЪгЫш 1805) (ШЕРЛ, 2000; ^&тп е! а1., 2009). Первый вид образует рои
на высоте около 1.5 м, что позволяет поддерживать его в культуре в обычном помещении. Два других вида и вовсе не требуют образования роя, их имаго спариваются на субстрате (Sadler, 1935; Benoit et al., 1997).
Постановка лабораторных экспериментов с участием хирономид нередко осуществляется по общепринятой методике, разработанной американским Агентством по защите окружающей среды (USEPA — United States Environmental Protection Agency). Эксперимент может быть как острым, продолжительностью всего несколько часов или суток, так и хроническим (долгосрочным), длящимся 10 или 20 суток; также, при необходимости, через 30—60 суток фиксируют число особей, которые завершили метаморфоз и способны далее участвовать в размножении (USEPA, 2000).
В эксперименте личинок рекомендуется содержать в емкости объемом 300 мл, а в качестве субстрата использовать кварцевый песок и глину, цвет которых может варьировать от желтого до темно-коричневого (USEPA, 2000). Это усложняет наблюдение за микроскопическими личинками в течение первых дней эксперимента, т.к. они почти прозрачны и трудно различимы на фоне грунта.
В анализе экспериментальных данных используют морфологические изменения (деформации ментума, антенн и структур на головной капсуле) (Томилина и др., 2011), биохимические (Choi, Ha, 2009) и цитогенетические (Michailova et al., 2000) характеристики как на индивидуальном, так и на
популяционном уровне. Выживаемость, плодовитость и способность к дальнейшему размножению также является важным показателем степени воздействия какого-либо фактора (USEPA, 2000; Marincovic et al., 2012).
Как правило, при постановке экспериментов не регистрируются особенности поведения личинок, т.к. без нарушения целостности их домика и извлечения личинки из грунта это сделать затруднительно. Любое подобное вмешательство оказывает негативное, стрессовое, влияние на животных и в итоге может привести к искажению результатов. Если содержать, к примеру, личинок C. plumosus L. 1758 без субстрата, то наблюдается их массовая гибель, связанная прежде всего с механическим повреждением покровов соседними особями и последующим вытеканием гемолимфы (Большаков, 2013).
Основной задачей нашего исследования стала разработка методики, позволяющей вести наблюдение за личинками хирономид, прежде всего лабораторных культур, в течение всего их жизненного цикла, исключив стресс вызываемый отсутствием субстрата.
Дополнить уже имеющийся арсенал методов и решить поставленную выше задачу можно используя прозрачный искусственный субстрат на основе агарозы — бактоагара. Бактоагар состоит из полисахаридов и отличается прозрачностью, в основном его используют в качестве плотной поддерживающей среды в микробиологии; реже в медицинской энтомологии, при культивировании насекомых-переносчиков возбудителей заболеваний человека и животных. По одной из методик хищных личинок мокрецов (Diptera, Ceratopogonidae) кормят гранулами, в состав которых входят сухие дрожжи, овечья кровь и агар (Sun, 1974), по другой методике, на залитом в чашки Петри агаре (1%), личинок мокрецов выращивают одновременно с нематодами, которые служат для хищных личинок пищей (Mullens, Velten, 1994).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В эксперименте использовали собственную лабораторную культуру Chironomus (Camptochi-ronomus) dilutus (Shobanov 1999) из Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН. Исходные кладки содержали в чашке Петри в воде при температуре 20—22°C, двое суток ждали проклевывания личинок, затем помещали по 35 личинок в четыре чашки Петри. Контроль и эксперимент ставили в двух повторностях.
В контроле основными компонентами субстрата были органические остатки растительного происхождения (продукты лигнификации древесины), ил и мелкий кварцевый песок в пропорции 1 : 1 : 1, этим субстратом заполняли чашку Петри до уровня 10 мм. В эксперименте основ-
ным компонентом субстрата был 1.5% бактоагар фирмы Ferak (Berlin), который в расплавленном состоянии заливали также до уровня 10 мм. В обоих случаях сверху наслаивали 4 мм воды, подмену 50% от ее объема осуществляли шприцем два-три раза в неделю. В течение всего эксперимента чашки Петри были накрыты колпаком из фильтровальной бумаги. Освещали лампами дневного света, в соотношении 8 ч свет/16 ч темнота. Во всех случаях нами были использованы пластиковые чашки Петри размером 100 х 15 мм и стандартизированная вода с общей жесткостью 5 мг-экв./л (Ca2+, Mg2+), уровнем pH от 7.1 до 7.6; температура воды поддерживалась на уровне 20—22°С. В качестве основного корма использовали высушенные и перемолотые в порошок листья крапивы (Ба-лушкина, Панкратова, 1983), которые (2 г крапивы) заливали кипящей водой (250 мл) и давали смеси остыть, после чего осадок промывали дистиллированной водой и пипеткой вносили в необходимом количестве (около 0.5 мл взвеси) в каждую чашку Петри. Наблюдение и регистрацию активности личинок осуществляли ежедневно в течение всего периода эксперимента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Закапывание в грунт крайне важно для личинок хирономид: при высокой плотности популяции, когда личинки начинают мешать друг другу, грунт служит естественной преградой между соседними особями; уменьшается число контактов между особями, что снижает скорость распространения болезней в популяции; равномерное распределение личинок в грунте способствуют более полному освоению ресурсов среды, а также равномерному распределению метаболитов (Константинов, 1958).
Предварительные результаты показали, что 1.5% бактоагар отвечает всем необходимым характеристикам в качестве искусственного субстрата. В отличие от стандартных субстратов (песка, глины и растительных остатков) он обладает рядом преимуществ: прежде всего он прозрачный, и одновременно с этим является источником питательных веществ. Личинки с легкостью проделывают в нем ходы, при этом поедая его. Уже в течение первых суток эксперимента некоторые личинки приступили к постройке трубок-домиков из порошка крапивы и начали проникать в бактоагар на глубину до 0.5—1 мм, оставаясь хорошо заметными для наблюдателя (рис. 1). В контроле личинки были неразличимы на фоне темного грунта.
Спустя неделю, на 8-й день эксперимента, благодаря наличию в гемолимфе красного гемоглобина, личинки становились еще заметнее. Даже на черно-белой фотографии личинка хорошо различима (рис. 2). В контроле личинок можно
1110
БОЛЬШАКОВ
% *
2 мм 1 1 а 2 мм 1 1 0
Рис. 1. Первые сутки эксперимента: а — личинка на поверхности бактоагара (вид сверху), б — личинка в домике из порошка крапивы и бактоагара (вид сверху).
Рис. 2. Личинка на 8-й день эксперимента (вид сбоку): 1 — слой воды, 2 — слой бактоагара, 3 — частицы крапивы, 4 —личинка С. ёИШш.
видеть лишь в короткие периоды времени, когда они выходят на поверхность грунта, собирая строительный материал для домика или пищу, что исключает постоянное наблюдение за их поведением.
С 14-го и во все последующие дни эксперимента личинки проникают на всю глубину бак-тоагара, и возможность наблюдения за поведением отдельных особей также сохраняется. К примеру, можно увидеть, как личинка совершает дыхательные движения (ундулирует) или меняет свое положение в трубке-домике (рис. 3).
Как отмечалось ранее, важной частью эксперимента является определение скорости развития и выживаемости особей. На 21-й день эксперимента в чашках Петри с бактоагаром оставалось 27 и 30 живых личинок, окукливание началось на 37-й день, завершили метаморфоз 17 и 19 особей, и последняя взрослая особь вылетела на 57-й день эксперимента (табл. 1, 2). В чашках Петри с контролем на 21-й ден
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.