НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 2, с. 118-121
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577
К ОБМЕНУ ГАМК И ГАМК-АМИДА В МОЗГЕ
© 2012 г. Р. Г. Камалян*, А. Г. Варданян
Институт биохимии НАН РА им. Г.Х. Бунятяна, Республика Армения, Ереван
Изучены утилизация глутамина и образование ГАМК в митохондриях мозга крыс, подвергнутых алюминиевой интоксикации, в условиях активации и ингибирования фосфатактивируемой глута-миназы (ФАГ). Показано отсутствие активирующего эффекта фосфата на активность "отравленных" алюминием крыс. Вместе с тем ингибирование ФАГ 6-диазо-5-оксо-норлейцином, как и в норме, не отражается на выходе ГАМК из глутамина. При интоксикации усиливается утилизация глутамина и выход ГАМК и его амида. Последний продуцирует больше аммиака у подвергнутых интоксикации крыс. В присутствии АТФ и сульфата аммония регистрируется также более выраженное при интоксикации усиление утилизации добавленной к митохондриям ГАМК. Полученные данные подтверждают выдвинутую одним из нас гипотезу о возможности образования ГАМК из глутамина через ГАМК-амид и свидетельствуют о большей устойчивости ГАМК-ергических систем к алюминиевой интоксикации, чем глутаматергических.
Ключевые слова: алюминиевая интоксикация, митохондрии, глутамин, ГАМК, ГАМК-амид.
ВВЕДЕНИЕ
Система нейроактивных аминокислот играет центральную роль в энергетических, информационных, трофических и когнитивных функциях мозга. Она вовлекается в патогенез гипоксии и ишемии, бокового амиотрофического склероза, заболеваний Хантингтона, Паркинсона и Альц-геймера, эпилепсии и шизофрении [1—4]. Несмотря на до конца не выясненную картину этиопато-генеза вышеперечисленных заболеваний множество агонистов и/или антагонистов ГАМК и глутамата используется в симптоматическом лечении указанных патологий [4, 5]. В связи с плохой проницаемостью гематоэнцефалического барьера в отношении нейроактивных аминокислот для регуляции их уровня в мозге используются соответствующие производные или предшественники, проникающие через барьер кровь-мозг и либо превращающиеся в мозге в нейроактивные аминокислоты, либо регулирующие активность ферментов их синтеза и распада. В частности, многие ингибиторы ГАМК-трансаминаза (1АМК-Т) применяются при эпилепсии для повышения уровня ГАМК и подавления судорожной активности [4—6]. Было показано, что повышение уровня ГАМК при этом не соответствует ожидаемой противоэпилептиче-ской активности, что объяснялось увеличением энергетического, но не трансмиттерного пула ГАМК [6]. Однако, согласно нашим данным, несоответствие это объясняется повышением уровня не только ГАМК, но и его амида, который при определении использованными методами детек-
*Адресат для корреспонденции: 0014, Ереван, ул. П. Севака, 5/1, тел. 276834; е-mail: kamalyan37@mail.ru.
тируется вместе с ГАМК, но не проявляет непосредственно активности последней [7]. Исходя из этого, нами исследовалась возможность образования и распада ГАМК-амида и его содержание в норме и при алюминиевой нейроинтоксикации как условной экспериментальной модели, имитирующей нейродегенеративный синдром, характерный для болезни Альцгеймера [8, 9]. Предпосылкой исследования послужили также данные о роли глутамат- и ГАМК-ергических механизмов при нейродегенерации [10, 11].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проведены на белых крысах-самцах массой 120 г, содержащихся в условиях вивария Института биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА на стандартном пищевом рационе. Подопытных животных забивали под легким эфирным наркозом путем декапитации, быстро извлекали мозг, готовили на холоду 10%-ные гомогенаты в 0.3 М растворе сахарозы на 0.05 М Трисе (pH 7.4), из которых методом дифференциального центрифугирования выделяли митохондрии [12]. Ядра удаляли центрифугированием при 0—3°C и 800 g в течение 10 мин на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге К-24 (Германия). Митохондрии выделяли центрифугированием при 18000 g в течение 20 мин, осадок промывали в трис-сахарозе и вновь центрифугировали при тех же оборотах 30 мин. Осадок суспендировали в среде, содержащей: 100 мМ KCl, 2.5 мМ манитола, 7 мМ сахарозы, 0.5 мМ MgSO4, 10 мМ HEPES. Митохондрии инкубировали 30 мин при 37°С в вышеуказанной среде с 10 мМ L-глутамина. Каждая проба содержала
Таблица 1. Утилизация глутамина и образование ГАМК в митохондриях крыс при алюминиевой интоксикации
Добавки Глутамин ГАМК
Содержание аминокислот в мкмоль/проба. N = 5.
- 10.5 ± 0.75 0.20 ± 0.006
Фосфат(Ф) 9.50 ± 0.60 0.18 ± 0.005
ПФ 5.35 ± 0.45* 0.57 ± 0.025*
Ф + ПФ 4.75 ± 0.35* 0.65 ± 0.030*
ДОН 9.50 ± 0.75 0.20 ± 0.015
ДОН + Ф 9.05 ± 0.85 0.25 ± 0.020
ДОН + ПФ 7.40 ± 0.55** 0.50 ± 0.035**
ДОН + Ф + ПФ 7.75 ± 0.50** 0.55 ± 0.020**
*p < 0.05 в сравнении с контролем **p < 0.05 — ПФ в сравнении с ДОН.
Таблица 2. Влияние алюминиевой интоксикации на уровень аминокислот в коре мозга крыс
Аминокислоты Глутамат Глутамин ГАМК ГАМК-амид
Интактная группа 7.2 ± 0.4 4.5 ± 0.3 2.2 ± 0.1 0.75 ± 0.03
Алюминиевая интоксикация 7.4 ± 0.5 3.4 ± 0.1* 2.8 ± 0.2* 1.25 ± 0.05*
Концентрация аминокислот в мкмоль/г ткани. N = 7.
митохондрии, полученные из 50 мг коры мозга. В отдельные пробы добавляли по 10 мМ NaH2PO4, 2 мМ пиридоксальфосфата (ПФ) и 3 мМ 6-диазо-5-оксо-норлейцина (ДОН) (табл. 1).
В отдельной серии исследований с изучением продукции аммиака из ГАМК-амида (табл. 3) и утилизации ГАМК (табл. 4) в митохондриях использовали инкубацию в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4) с добавлением соответственно 5 мМ ГАМК-амида и 10 мМ ГАМК.
В опытах использовали реактивы "Sigma Chemical Company". ГАМК-амид был синтезирован в лаборатории синтеза аминокислот и пептидов Института тонкой органической химии им. Мнджоя-на НАН РА зав. лабораторией Казаряном С.А. путем синтеза хлорангидрида ГАМК и последующего его аммонолиза. Полученный препарат ГАМК-амида был очищен хроматографией на колонке с Dowex-1 и лиофилизирован. Препарат был идентифицирован по элементарному составу, масс- и магнитно-резонансному спектрам, а также по биологической активности [7, 13].
Аминокислоты разделяли с помощью высоковольтного электрофореза на бумаге и определяли нингидриновым методом [14]. Перхлоратные экстракты коры мозга после нейтрализации 2 М KOH-ем концентрировали в ротационном испарителе, растворяли в небольшом объеме дистиллированной воды и наносили по 50 мкл на электро-
форетические ленты (бумага FN-11). Электрофорез проводили в пиридин-ацетатном буфере (рН 4.0) при напряжении 1200 V и силе тока 0.5 тА/см бумаги в течение 1.5 ч. После высушивания электрофоретические ленты окрашивали нингидрином, окраску элюировали раствором 0.005% Си804 в 75%-ном спирте и после часовой экспозиции измеряли на "8ресо1-11" (Германия) интенсивность окраски при 540 нм. Количество аминокислот высчитывали по стандартным кривым.
Количество глутамина и амида ГАМК рассчитывали по содержанию амидного азота в электро-форетических фракциях глутамина и ГАМК микродиффузионным методом, который использова-
Таблица 3. Продукция аммиака из ГАМК-амида при инкубации с митохондриальной фракцией мозга
Группа Фиксированный контроль Контроль инкубации
Интактные крысы 0.09 ± 0.01 1.65 ± 0.20**
Алюминиевая ин- 0.13 ± 0.01* 2.20 ± 0.23**
токсикация
Количество аммиака в мкмоль/проба. N = 5.
120 КАМАЛЯН, ВАРДАНЯН
Таблица 4. Утилизация ГАМК в митохондриях коры мозга интактных и отравленных алюминием крыс
Группа АТФ ПФ АТФ + + (МН4)2ЯО4 ПФ + + (МН4)2ЯО4 АТФ + ПФ + + (МН4)2ЯО4
Интактные крысы Алюминиевая интоксикация 10.2 ± 0.9 10.5 ± 0.7 9.9 ± 0.7 9.85 ± 0.6 9.7 ± 0.8 8.9 ± 0.8 7.5 ± 0.9* 8.8 ± 0.5* 10.1 ± 1.2 9.4 ± 0.8 7.1 ± 0.8* 6.1 ± 0.6*
В отдельные пробы добавлено по 2мМ (МЩ^О^ АТФ и ПФ. N = 5.
ли также для определения аммиака [15]. Алюминиевый токсикоз вызывали путем внутри-брюшинного введения крысам 0.3 мл 10%-ного раствора А1С13. Контрольным крысам вводили физраствор. Повторное введение производили спустя три дня. Крыс, подвергнутых воздействию алюминия, забивали на 30-й день. В отдельной серии опытов была изучена утилизация глутамина в митохондриях мозга крыс спустя 30 дней после алюминиевой нейроинтоксикации.
Результаты подвергнуты статистической обработке с использованием критерия Стьюдента, значимые изменения (р < 0.05) отмечены крестиком.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Представленные в табл. 1 результаты определения глутамина показывают, что митохондрии в этих условиях не утилизируют добавленный глута-мин. Эффективные в норме концентрации мощного активатора фосфатактивированной глутами-назы (ФАГ) фосфата (5—10 мМ) не влияют на утилизацию глутамина в митохондриях мозга. В то же время ПФ сохраняет констатированный нами в норме стимулирующий эффект на утилизацию глутамина и выход ГАМК [16, 17]. ПФ вдвое повы-
Глутомат декарбоксилаза
Глу
ГАМК
Глн -
ГАМК-амид
Глутамат декарбоксилаза 65?
Классический и альтернативный пути образования ГАМК из глутамина.
шает утилизацию глутамина, в основном стимулируя образование ГАМК. Образования глутамата почти не наблюдается, что свидетельствует скорее о синтезе ГАМК через его амид, что более выражено при алюминиевом токсикозе. Процесс образования ГАМК из глутамина не страдает при подавлении активности ФАГ специфическим ингибитором ДОН, что также говорит об альтернативном пути синтеза ГАМК, имеющем при алюминиевом отравлении, по-видимому, адаптивное значение. ПФ на фоне ингибирования ФАГ столь же активно стимулирует выход ГАМК, как и без него. Представляет интерес исчезновение активирующего эффекта фосфата на ФАГ при алюминиевом ней-ротоксикозе. Можно предполагать, что имеет место диссоциация димерной активной формы фермента или его конформационные изменения, снижающие сродство к фосфату, однако ответ на этот вопрос требует дальнейших экспериментов.
В табл. 2 представлены данные по содержанию аминокислот в коре мозга крыс при алюминиевой интоксикации. Как видно из таблицы, содержание ГАМК и его амида в отравленном алюминием мозге статистически значимо повышено соответственно на 27.3 и 66.7%, а уровень глутамина понижен в сравнении с интактным мозгом на 24.5%. Концентрация глутамата при этом статистически значимых изменений н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.