научная статья по теме КАЛИКС[4]АРЕН C-90 СЕЛЕКТИВНО ИНГИБИРУЕТ CА 2+,MG 2+-АТРАЗУ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК МИОМЕТРИЯ Химия

БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 5, с. 532 - 540

УДК 577.152.3+544.147

КАЛИКС[4]АРЕН С-90 СЕЛЕКТИВНО ИНГИБИРУЕТ Ca2+,Mg2+-ATPa3y ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ КЛЕТОК МИОМЕТРИЯ*

© 2014 Т.А. Веклич1**, А.А. Шкрабак1, [Н.Н. Слинченко]1 Ю.Ю. Мазур1, Р.В. Родик2, В.И. Бойко2, В.И. Кальченко2, С.А. Костерин1

1 Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, 01601 Киев, ул. Леонтовича, 9; факс: +38(044)279-6365, электронная почта: veklich@biochem.kiev.ua

2 Институт органической химии НАН Украины, 02660 Киев, ул. Мурманская, 5; факс: +38(044)573-2643, электронная почта: vik@ioch.kiev.ua

Поступила в редакцию 19.11.13 После доработки 14.01.14

С использованием фракции плазматических мембран клеток миометрия и препарата очищенной Са2+,М^2+-АТРазы, солюбилизированной из данной субклеточной структуры, продемонстрировано, что супрамолекулярное соединение — каликс[4]арен С-90 (5,11,17,23-тетра(трифтор)метил-(фенилсульфонил-имино)метиламино-25,26,27,28-тетра-пропоксикаликс[4]арен) — эффективно ингибирует АТР-гидролаз-ную активность: величина коэффициента ингибирования 105 составляет 20,2 ± 0,5 и 58,5 ± 6,4 мкМ соответственно. Ингибирующее действие каликс[4]арена С-90 селективно относительно других АТРаз, локализованных в плазматической мембране: он не влияет на активности №+,К+-АТРазы и «базальной» М^2+-АТРазы. Ингибирующий эффект каликс[4]арена С-90 на активность Са2+,М^2+-АТРазы связан с кооперативным действием четырех трифторметилфенилсульфонилиминовых (сульфониламидиновых) групп, однонаправ-ленно ориентированных на верхнем ободе каликс[4]аренового макроцикла (каликс[4]ареновой «чаши»). Полученные экспериментальные данные могут иметь значение для исследования с использованием ка-ликс[4]арена С-90 молекулярных и мембранных механизмов регуляции концентрации Са2+ в гладкомышеч-ных клетках, изучения роли Са2+-насоса плазматической мембраны в контроле электро- и фармакомехани-ческого сопряжения в миоцитах.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Са2+,М^2+-АТРаза, кальциевый насос плазматической мембраны, гладкомышечные клетки, миометрий, каликс[4]арены, сульфониламидины.

Ионам кальция (Са2+) принадлежит фундаментальное значение в обеспечении электро- и фармакомеханического сопряжения в гладких мышцах, в том числе и в миометрии [1]. Концентрация Са2+ ([Са2+]1) в расслабленных гладкомы-шечных клетках (ГМК) составляет около 100 нМ, что примерно в 104 раз меньше, чем во внеклеточной среде (~10-3 М). Внеклеточный Са2+ является важнейшим фактором активации сокращения ГМК. При возбуждении величина [Са2+] повышается, по крайней мере, до нескольких сотен нМ, но не более, чем до 1 мкМ. Такое повы-

Принятые сокращения: ГМК — гладкомышечные клетки, ПМ — плазматическая мембрана.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-319, 30.03.2014.

** Адресат для корреспонденции.

шение концентрации Са в миоцитах обеспечивается за счет пассивного поступления в миоциты через кальциевые каналы плазматической мембраны (ПМ), а также посредством выброса данного катиона из основного внутриклеточного кальциевого депо — саркоплазматического ретикулу-ма; освобождение Са2+ из митохондрий также имеет место [2, 3]. Релаксация («терминация») кальциевого сигнала осуществляется благодаря функционированию систем активного транспорта ионов Са — М^2+,АТР-зависимых кальциевых насосов ПМ и саркоплазматического ретикулума (Са2+ ,М^2+-АТРаз) (тапсигаргин-нечувствитель-ного и тапсигаргин-чувствительного соответственно), №+-Са2+-обменника ПМ, а также Са2+-унипортера митохондрий [4]. В целом динамика изменения [Са2+] есть следствие суперпозиции функционирования мембраносвязанных систем пассивного и активного транспорта ионов Са.

В миоцитах матки именно М^2+,АТР-зависи-мый кальциевый насос ПМ, обладающий высоким сродством к ионам Са (значение константы активации по Са2+ КСа2+ составляет 0,3—0,6 мкМ), выполняет важнейшую роль в контроле [Са2+] [5, 6], поскольку сродство к Са2+ для №+-Са2+-обменника ПМ (КСа2+ « 7—50 мкМ) значительно меньше, чем для кальциевого насоса. Результаты кинетического анализа транссарколеммаль-ного обмена Са2+ показывают, что этот насос, функционирующий на фоне непрерывно входящего в невозбужденные миоциты матки медленного диффузионного кальциевого потока (10-15—10-14 моль Са2+/см2 за 1 с), вполне способен обеспечить долговременное стационарное поддержание величины [Са2+] в миоплазме на уровне <10-6 М. Соответственно, кальциевый насос ПМ является важнейшим элементом общего механизма контроля базального тонуса миометрия. Если бы этот насос не существовал, то, с учетом насыщаемости внутриклеточных структур ионами Са, примерно через 100 сокращений, активируемых входом в ГМК внеклеточного Са2+ в результате серии деполяризирующих импульсов, миоциты перешли бы в состояние стойкой контрактуры [7].

Использование селективных ингибиторов энергозависимых Са2+-транспортирующих систем крайне необходимо для изучения роли последних в контроле клеточных функций в норме и при патологических состояниях. Неспецифическими ингибиторами Са2+,М^2+-АТРазы ПМ являются, в частности, о-ванадат и эозин. Однако о-ванадат ингибирует не только Са2+,М^2+-АТРазу и Ма+,К+-АТРазу ПМ, но и опосредованно — систему Ма+-Са2+-обмена, локализованную в этой же субклеточной структуре (вследствие блокирования активности натриевого насоса и, соответственно, уменьшения величины трансмембранного натриевого градиента). Эозин же блокирует Са2+- и Ма+-транспортирую-щие АТР-гидролазы ПМ, а также Са2+-транс-портирующую АТР-гидролазу сарко(эндо)плаз-матического ретикулума [8]. Недавно в литературе были описаны новые относительно селективные ингибиторы кальциевого насоса ПМ — пептиды калоксины [9]. Между тем, низкомолекулярные селективные ингибиторы Са2+,М^2+-АТРазы ПМ неизвестны. Очевидно, однако, что поиск их является крайне важным в практическом отношении, так как нетоксичные для организма соединения, селективно блокирующие функционирование Mg2+,ATP-зависимого кальциевого насоса ПМ, перспективны для создания фармакологических препаратов, регулирующих тонус и сократительную активность матки при патологических состояниях (слабость родо-

вой деятельности, гипотонус матки, маточные кровотечения и др.).

В этой работе мы приводим результаты исследований, свидетельствующих о том, что соединение каликс[4]арен С-90 способен к селективному (относительно других АТР-гидролаз-ных систем) ингибированию Са2+, Mg2+-ATPазы ПМ клеток миометрия.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Каликс[4]арены. Каликс[4]арены были синтезированы в отделе химии фосфоранов Института органической химии НАН Украины (зав. отд. — член-корр. НАН Украины проф. В.И. Каль-ченко), каликс[4]арен С-90 был синтезирован, как описано ранее [10]. Структура синтезированных каликс[4]аренов была подтверждена с использованием методов инфракрасной и ЯМР-спектроскопии.

В экспериментах были использованы следующие соединения:

каликс[4]арен С-90 — (5,11,17,23-тетра(три-фтор)метил-(фенилсульфонилимино)метилами-но-25,26,27,28-тетра-пропоксикаликс[4]арен), а также его аналоги:

каликс[4]арен C-715 — 5,17-ди(трифтор)аце-тамидо-11,23-ди-третбутил-25,27-дипропок-си-каликс[4]арен;

каликс[4]арен C-716 — 5,17-ди(трифтор)ме-тил(фенилсульфонилимино)-метиламино-11,23-ди-третбутил-25,27-дипропоксикаликс[4]арен;

каликс[4]арен C-772 — 5,11-ди(трифтор)ме-тил(фенилсульфонилимино)-метиламино-17,23-ди-третбутил-26,27-дипропоксикаликс[4]арен;

каликс[4]арен С-150 — 25,27-дипропокси-ка-ликс[4]арен (собственно каликс[4]ареновая «чаша»);

соединение М-1 — М-(4-этоксифенил)-№-(фенилсульфонил)-трифторометилацетимидо-амид (структурный фрагмент молекулы каликс[4]-арена С-90).

Структурные формулы исследованных веществ приведены на рис. 1.

Биохимические исследования. Биохимические исследования по изучению влияния каликс[4]-аренов на активность Са2+,М^2+-АТРазы в ЙМ ГМК матки были проведены в отделе биохимии мышц Института биохимии им. А.В. Йалладина НАН Украины (зав. отделом — член-корр. НАН Украины проф. С.А. Костерин).

Фракцию ЙМ ГМК выделяли из миометрия свиньи, как было описано ранее [11, 12].

Содержание белка в мембранной фракции определяли методом Брэдфорд [13].

Са2+,М^2+-АТРазную активность определяли во фракции ЙМ клеток миометрия при 37° в

среде (объем — 0,4 мл), содержавшей 3 мМ АТР, 3 мМ MgCl2, 0,95 мМ CaCl2, 25 мМ NaCl, 125 мМ КС1, 1 мМ ЭГТА, 20 мМ Hepes-Tris-буфер (рН 7,4), 1 мМ NaN3 (ингибитор АТРазы митохондрий [14]), 1 мМ уабаина (ингибитор Na+,K+-АТРазы [15]), 0,1 мкМ тапсигаргина (селективный ингибитор Са2+,Mg2+-АТРазы эн-до(сарко)-плазматического ретикулума [14]) и 0,1% дигитонина (фактор перфорации ПМ [16]). Количество белка мембранной фракции в пробе — 20—30 мкг. Время инкубации — 5 мин. Реакцию инициировали введением в среду инкубации аликвоты (50 мкл) суспензии ПМ, а останавли-

вали добавлением к инкубационной смеси 1 мл «стоп»-раствора следующего состава: 1,5 М натрий уксуснокислый, 3,7%-ный формальдегид, 14%-ный этанол, 5%-ная ТХУ, рН 4,3 (при 8°). Са2+,М^2+-АТРазную активность рассчитывали по разности между величинами АТРазной активности в присутствии и в отсутствие ионов Са. В наших экспериментах среднее значение удельной ферментативной активности Са2+,Мё2+-АТРазы ПМ миоцитов матки составляло 3,4 ± 0,3 мкмоль Р/мг белка за 1 ч (М ± т; п = 7).

Препарат очищенной транспортной Са2+,Mg2+-АТРазы, солюбилизированной с использовани-

HN °

Oi-^

С-90

С-772

"L

он ]

«Каликс[4]ареновая чаша» С-150

Л-+0

С-715

Соединение М-1

Рис. 1. Структурные формулы исследованных каликс[4]аренов и соединения М-1

ем тритона Х-100, был получен из ПМ клеток миометрия свиньи при помощи метода аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе 4В, как было описано ранее [17]. Активность со-любилизированной Са2+,М^2+-АТРазы определяли при температуре 37° в стандартной среде инкубации (объем — 0,2 мл) следующего состава: 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 125 мМ КС1, 25 мМ NaCl, 3 мМ АТР, 3 мМ MgC12, 0,1 мМ СаС12, 0,1 мМ ЭГТА, 1,5—2,0 мкг белка. Время инкубации — 10 мин. По результатам Ds-Na-ПААГ-электро-фореза препарат очищенного фермента с

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.