НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 3, с. 257-265
КЛИНИЧЕСКАЯ НЕЙРОХИМИЯ
УДК 577.352
КАЛПАИНОПОДОБНАЯ И ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ АКТИВНОСТИ В СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ БОКОВЫМ АМИОТРОФИЧЕСКИМ СКЛЕРОЗОМ
© 2007 г. Л. В. Брылев1 2, А. А. Яковлев2, М. В. Онуфриев2, М. Н. Захарова1,
И. А. Завалишин1, Н. В. Гуляева2*
1 ГУ НИИ неврологии РАМН 2 Лаборатория функциональной биохимии нервной системы, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, РАН, Москва
Боковой амиотрофический склероз (БАС) - нейродегенеративное заболевание, в основе которого лежит гибель мотонейронов. Для выяснения возможной роли калпаина в гибели нейронов при БАС проведено измерение калпаиноподобной активности в спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с БАС и пациентов контрольной группы. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в СМЖ группы БАС была достоверно выше, чем в группе контроля, что, по-видимому, отражает гибель нейронов ЦНС при БАС. Калпаиноподобная активность (КПА), измеренная при рН 7.4, не различалась в группах БАС и контроль, однако при рН 5.5 была достоверно выше у пациентов с БАС. Более того, в группе БАС обнаружена высокодостоверная корреляция КПА при рН 5.5 с активностью ЛДГ, что указывает на возможную связь этой КПА с гибелью нейронов. Представлены данные о зависимости КПА и ЛДГ от формы БАС, длительности и темпа развития заболевания.
Ключевые слова: калпаин, лактатдегидрогеназа, нейродегенерация, боковой амиотрофический склероз, спинномозговая жидкость.
Боковой амиотрофический склероз (БАС) относится к группе наиболее тяжелых нейродегене-ративных заболеваний ЦНС и характеризуется сочетанным поражением мотонейронов головного и спинного мозга, неуклонно прогрессирующим течением заболевания, отсутствием эффективных методов лечения в связи с отсутствием окончательного понимания патогенеза БАС и механизмом гибели нейронов [1]. Современные взгляды на патогенез бокового амиотрофическо-го склероза, который до сих пор остается заболеванием с неизвестной этиологией, включают в себя представление о важной роли окислительного стресса, эксайтотоксичности, конформационных изменений белков, митохондриальной патологии и недостатке нейротрофических факторов в развитии этой патологии [2-4]. В последние годы укрепляется представление о роли аберрантного клеточного цикла и циклин-зависимых киназ как триггеров нейродегенеративного процесса [5-7].
Одним из подходов к пониманию механизмов гибели нейронов при нейродегенеративных заболеваниях является анализ белков спинномозговой жидкости (СМЖ) в поисках маркеров нейродеге-нерации [8-12]. Этот подход неоднократно использовался ранее применительно к БАС: напри-
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а; е-таП: nata_gul@pisem.net
мер, показано изменение уровней антинейро-нальных аутоантител [13, 14], каспазы 1 и растворимого рецептора АPО-1/Fas/CD 95 [15], гормона роста, ЮБ-1 и инсулина [16], тау-белка и белка S100 бета [17].
В последнее время протеазам уделяют особое место в механизмах гибели нейронов [18-20]. В связи с этим предпринимаются попытки исследования протеиназ у больных нейродегенеративны-ми заболеваниями. Так, в СМЖ больных БАС обнаружены измененные уровни матриксных ме-таллопротеиназ [21] и их ингибиторов [22].
Среди важнейших для осуществления программы гибели нейронов протеолитических ферментов находится калпаин, участие которого в запрограммированной гибели нервных клеток активно и достаточно продуктивно исследуется [23, 24]. Можно предположить, что калпаин играет роль в гибели нейронов при БАС.
Задача настоящей работы - исследование активности калпаина в СМЖ больных БАС и выяснение его возможной связи с гибелью мотонейронов. Для оценки гибели клеток параллельно определяли в СМЖ активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Пациенты. Клиническое обследование больных проводилось в нейроинфекционном отделении НИИ неврологии РАМН. У всех больных была детально изучена клиническая картина заболевания с использованием данных анамнеза, неврологического и соматического статуса, а также результатов нейроофтальмологического и отоневрологического исследований. Всем больным проводилось электромиографическое исследование и оценка функции внешнего дыхания методом спирометрии.
В настоящей работе представлены результаты клинико-биохимического исследования 30 больных БАС. В обследуемую группу были включены больные с достоверным диагнозом БАС, у которых были выявлены либо признаки поражения верхнего и нижнего мотонейрона на уровне ствола головного мозга и на двух спинальных уровнях, либо только на трех спинальных уровнях [25].
У всех больных проводилось динамическое клиническое и биохимическое обследование. Контрольную группу составили 19 больных с острой хирургической патологией, которым проводилась спинномозговая анестезия.
Диагноз БАС ставился больным на основании сочетания признаков: 1) поражения нижнего мотонейрона (по данным клинического и электрофизиологического исследований); 2) поражения верхнего мотонейрона (по данным клинического исследования); 3) неуклонно прогрессирующего течения заболевания при динамическом наблюдении за больными в течение 2 и более лет с постоянным контролем каждые 6 месяцев [25].
В некоторых случаях для исключения БАС-подобных синдромов были применены биохимические, иммунологические и рентгенологические методы исследования, включая компьютерную томографию и магнитно-резонансную томографию головного и спинного мозга.
Среди общего числа больных БАС было 15 (50%) мужчин и 15 (50%) женщин. В контрольной группе, соответственно, 10 (53%) мужчин и 9 (47%) женщин. Возраст больных БАС от 30 до 76 лет составлял в среднем 51.4 ± 11.6 лет. В контрольной группе у пациентов с острой хирургической патологией - 58.5 ± 12.3 лет, т.е. основная и контрольная группы сопоставимы по возрасту и полу. В зависимости от первичного уровня поражения выделено 3 группы больных с различными формами БАС, согласно ранее предложенным классификациям [26, 27]. Шейно-грудная форма была отмечена у 15 (50%) больных БАС, пояс-нично-крестцовая - у 8 (27%), бульбарная - у 7 (23%).
Все больные были также разделены на подгруппы в зависимости от варианта течения, длительности заболевания и темпа прогрессирования
патологического процесса. Смешанный вариант течения заболевания, характеризующийся одинаковой степенью поражения верхнего и нижнего мотонейронов, встречался у половины больных -15 (50%). Преобладание сегментарно-ядерных нарушений ("переднероговой вариант") или пирамидной симптоматики наблюдалось у 8 (27%) и 7 (23%) больных соответственно. Длительность заболевания до 1 года отмечена у 15 больных (50%), от 1 года до 2 лет - у 10 (33%), более 2 лет - у 5 (17%).
Темп прогрессирования у больных оценивали по нарастанию неврологического дефицита (с использованием функциональной шкалы неврологического дефицита - ALS Functional Rating Scale, FRS) и скорости распространения патологического процесса на другие уровни [28, 29]. Шкала включает в себя 10 параметров, каждый из которых оценивается по 4-балльной шкале в зависимости от степени тяжести неврологических нарушений. В норме суммарная оценка по шкале составляет 40 баллов. Быстрый темп прогрессирования характеризовался нарастанием неврологического дефицита со снижением по шкале на 10 и более баллов в течение года и генерализацией процесса в течение первого года заболевания. При медленном темпе прогрессирования снижение суммарного показателя оценки неврологического дефицита не превышало 10 баллов за год, при этом генерализация процесса наблюдалась через год и более от начала заболевания. В обследованной группе быстрый темп прогрессирования наблюдался у 18 (60%) больных, медленный - у 12 (40%) человек.
Быстропрогрессирующее течение БАС наиболее часто встречалось у больных от 40 до 60 лет (71%) и старше 60 лет (50%), у пациентов моложе 40 лет в 40% случаев.
Биохимическое исследование. Определение концентрации белка проводили по методу Бред-форд с использованием БСА в качестве стандарта [30].
Определение активности ЛДГ проводили согласно методическим рекомендациям, приведенным в [31], с модификациями. Образец СМЖ (40 мкл) смешивали с реакционной средой (40 мкл), конечные концентрации реагентов: 25 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 мМ пируват, 0.1 мМ NADH (все реактивы производства Sigma, США). После 5 мин инкубации при 37°C к реакционной смеси добавляли 12.5 мкл 5 N HCl и инкубировали 15 мин при комнатной температуре для удаления непрореа-гировавшего nadh. Затем к пробам добавляли 0.5 мл 6 N NaOH, инкубировали 10 мин при 60°С и измеряли флюоресценцию при длинах волн возбуждения и эмиссии 360 и 460 нм соответственно. В качестве стандартной пробы использовали 0.05 мг/мл ЛДГ (Sigma, США) в 25 мМ Tris-HCl,
pH 7.5. Все образцы измерены в двух параллелях. Активность фермента выражали в нмоль/мин/мг белка.
Калпаиноподобную активность при нейтральном значении pH 7.4 (КПАн) определяли согласно [32], с некоторыми модификациями. Образец спинномозговой жидкости (100 мкл) смешивали с реакционной средой (100 мкл), конечные концентрации реагентов: 50 мМ MES (Serva, ФРГ), pH 7.4, 2.5 мМ CaCl2, 5 мМ DTT (Sigma, США), 100 мкМ флюорогенный субстрат калпаина Ac-LY-AMC (Biomol, США), по 5 мкг/мл апротинина и пепстатина (ICN, США), 0.5 мМ фенилметил-сульфанилфторид (Sigma, США). Проба содержала от 20 до 65 мкг белка. После 22 ч инкубации при 37°C измеряли флюоресценцию при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 и 440 нм соответственно. Калибровочную кривую строили по флюоресценции свободного АМС (Sigma, США), активность выражали в пмоль/мин/мг белка.
Калпаиноподобную активность при кислом значении pH 5.5 (КПАк) определяли тем же способом в таких же условиях, за исключением pH реакционной среды.
В дополнительных экспериментах определяли степень ингибирования КПАк специфическим ингибитором калпаина ALLN (Biomol, США). Использовали три концентрации ингибитора: 5, 20 и 50 мкМ. Результаты выражены в виде среднего процента остаточной активности для каждой концентрации ингибитора.
Большинство проб СМЖ не были центрифугированы пер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.