ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 575-581
УДК 581.1
КАЛЬЦИЙ СПОСОБСТВУЕТ АДАПТАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК СОЛОДКИ К ВОДНОМУ СТРЕССУ, ИНДУЦИРОВАННОМУ
ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ
© 2004 г. М. Ли, Г. Ван*, Ц. Лин
Главная государственная лаборатория агроэкологии засушливых районов, Университет Ланьчжоу,
Ланьчжоу, Китай * Школа биологии, Университет провинции Чжэцзян, Ханчжоу, Китай Поступила в редакцию 09.09.2002 г.
Кальций может повышать выносливость растений к недостатку воды, регулируя метаболизм анти-оксидантов и/или водный обмен. Мы исследовали возможное влияние обработки культивируемых клеток солодки (ОусуггЫга ига1ет1з КзсЬ.) Са2+ на их устойчивость к дефициту воды. Водный стресс, индуцированный 15% ПЭГ, вызвал достоверное снижение сырого веса клеток солодки и относительного содержания в них воды. Однако обработка Са2+ заметно увеличивала эти параметры за 7 сут стресса. При недостатке воды падала активность каталазы (КАТ), супероксиддисмутазы (СОД) и постепенно возрастала активность пероксидазы (ПОД). Обработка Са2+ слабо влияла на активность ПОД, но заметно активировала КАТ и СОД. Влияние Са2+ на выносливость к дефициту воды не было связано с регуляцией осмотического давления в среде. В нормальных условиях добавление Са2+ слегка активировало СОД, КАТ и ПОД. Сигналы, посылаемые Са2+ в условиях водного стресса и без него, могут различаться. При водном стрессе кальциевый сигнал передается по пути, компонентами которого являются активные формы кислорода (АФК), и влияет на процессы, регулирующие ферменты антиоксидантной защиты. При нормальных условиях поступающий извне кальциевый сигнал, по-видимому, не передается через АФК и не приводит к проявлению антиоксидантной ответной реакции. За 7 сут стресса в обработанных Са2+ клетках накапливалось меньше малонового диальдегида, чем в контрольных клетках. Обработка Са2+, по-видимому, смягчает повреждение, вызываемое водным стрессом, и повышает устойчивость к нему, ослабляя окислительный стресс.
аусуггЫка uralensis - антиоксидантные ферменты - Са2+ - ПЭГ - водный дефицит
Кальций играет важную роль в регуляции метаболизма растительной клетки. Более того, в последние годы было показано, что ионы кальция могут участвовать в регуляции ответных реакций растений на высокую и низкую температуру [1, 2], засуху [3] и засоление [4]. Данные, полученные в разнообразных исследованиях, показали, что засуха может вызывать в растениях окислительный стресс [5, 6]. Окислительный стресс индуцируется образованием активных форм кислорода (АФК),
таких как супероксид (0'2), перекись водорода
(Н202) и гидроксил-радикал (ОН'), которые вредны для выживания растений при водном стрессе. Образование АФК повреждает клетки и, в конце концов, приводит к их гибели, главным образом,
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; МДА -малоновый диальдегид; КАТ - каталаза; ОСВ - относительное содержание воды; ПОД - пероксидаза; СОД - суперок-сиддисмутаза.
Адрес для корреспонденции: Genxuan Wang. State Key Laboratory of Arid Agroecology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China. Fax:+86-931-891-2893; e-mail: wanggx@lzu.edu.cn
из-за повреждения реакционных центров ФС II и липидов мембран [3]. Токсичности АФК в клетке растения противостоит мощная антиокислительная система, включающая как ферменты (например, супероксиддисмутазу (СОД) (КФ 1.15.1.1), пероксидазу (ПОД) (КФ 1.11.1.7), каталазу (КАТ) (КФ 1.11.1.6)), так и другие соединения (например, аскорбат, каротиноиды, а-токоферол) [7, 8]. Эта система может обезвреживать АЦК [9, 11]. Ранее мы предположили, что активность ферментов антиоксидантной защиты, таких как суперок-сиддисмутаза (СОД), пероксидаза (ПОД) и ката-лаза (КАТ), в листьях проростков солодки меняется во время водного стресса [12]. Водный стресс может приводить к окислительному стрессу в клетках солодки. АФК - важный компонент сигнальных систем; они могут вызывать развитие защитной реакции в ответ на биотический и абиотический стрессы, изменяя активность соответствующих ферментов [3].
Появились сообщения, что обработка Са2+ проростков сои и хвойного растения CunningЫamia 1агсеоШа активировала ферменты антиоксидант-
ной защиты и снижала содержание малонового диальдегида (МДА) при водном стрессе [13, 14]. Однако, насколько нам известно, нет прямых данных о регуляции введенным извне Ca2+ активности этих ферментов при водном стрессе. Поскольку культивируемые клетки могут адаптироваться к водному стрессу на клеточном уровне, исследования, проведенные на таких клетках, помогут понять процессы, происходящие при водном стрессе.
Солодка, широко используемая в традиционной китайской медицине, растет главным образом в северо-западной части Китая. Это растение успешно противостоит засухе, а также высокой и низкой температуре [15, 16]. Обычно оно произрастает на богатых кальцием почвах в засушливых и полузасушливых районах [15, 17]. Таким образом, солодка - это удобный объект для изучения влияния кальция на ответную реакцию растения на дефицит воды.
Для создания дефицита воды в клеточной суспензии мы добавляли к среде ПЭГ-8000, который не проникает в клетки и таким образом не влияет на их осмотический статус [18, 20]. В нашей лаборатории были получены линии клеток солодки, способные расти при концентрациях ПЭГ вплоть до 15%.
Задачей данной работы было исследовать участие Ca2+ в развитии выносливости клеток солодки к дефициту воды и влияние обработки Ca2+ на активность ферментов антиоксидантной защиты и осмотический статус клеток при водном стрессе.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Семена солодки (Glycyrrhiza uralensis Fisch.) были собраны в пустыне провинции Ганьсу на северо-западе Китая. Для ускорения прорастания их погружали на 30 мин в 85%-ную H2SO4, промывали стерильной дистиллированной водой в течение 10 мин и стерилизовали 0.1%-ной HgCl2 в течение 15 мин. Семена помещали на поверхность твердой МС-среды (0.8%-ный агар), содержавшей 3% сахарозы и не содержавшей ауксин, с рН 5.8, и инкубировали при 25°C и фотопериоде 15 ч.
Получение каллусов. Отрезанные семядоли помещали на поверхность 0.8%-ного агара, содержавшего МС-среду, 3% сахарозы, 1-2 мг/л 2.4-Д, 1 мг/л БАП и 500 мг/л казеина при рН 5.8. Каллусы получали при инкубировании семядолей при 25°С и освещении в течение 15 ч в сутки.
Культура клеток. Для получения суспензионной культуры 1 г каллусной ткани суспендировали в 250-миллилитровых колбах с 50 мл жидкой МС-среды, содержавшей 1 мг/л 2.4-Д (pH 5.8). Клетки культивировали при 25°C на ротационной мешалке (120 об/мин) при освещении 30 мкЕ/(м2 с) в те-
чение 12 ч. Каждую недели клетки (4%-ный ино-кулум) переносили на свежую питательную среду. Осмотическому стрессу подвергали клетки, которые были не старше 6 мес.
Водный стресс и обработка СаС12. ПЭГ-8000 добавляли к жидкой среде до концентрации 15% (вес/объем) до подведения рН до 5.8 (25 мл среды на пробирку). Водный потенциал среды после автоклавирования был -1 МПа для МС-среды и -6.5 МПа для МС + 15% ПЭГ. Суспензию клеток (по 1 г) переносили в культуральные сосуды и добавляли СаС12 в 5-повторности.
Измерение сырого веса и относительного содержания воды. Клетки собирали центрифугированием при 500 g в течение 7 мин и тщательно обсушивали перед взвешиванием для определения сырого веса (Всыр). Другую порцию клеток в стерильных условиях переносили на нейлоновую ткань с порами размером 300 мкм и помещали на поверхность воды при комнатной температуре на 4 ч. Затем их обсушивали и взвешивали для определения веса при насыщении водой (Вт). Сухой вес (Всух) измеряли после высушивания пробы при 85°С в течение 24 ч на предварительно взвешенных алюминиевых подложках. Относительное содержание воды (ОСВ) определяли по формуле:
ОСВ (%) = (ВСЬ1р - Всух)/(Вт - Всух) х 100%.
Активность ферментов. Замороженные клетки (1 г сухого веса) растирали в охлажденной ступке с 3 мл 0.05 M Ка2НР04/КаН2Р04-буфера, рН 7.0. Гомогенат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали при 4°C при 15000 g в течение 20 мин. Супернатант собирали и использовали для определения активностей ферментов и содержания МДА.
Активность СОД определяли по методу Gian-nopolitis и Ries [21]. За единицу активности принимали количество СОД, необходимое для подавления вдвое скорости восстановления тетразолия нитросинего. Оптическую плотность измеряли при 560 нм. Активности КАТ и ПОД определяли методом Chance и Maehly [19]. В случае ПОД измеряли окисление гваякола по увеличению поглощения при 470 нм. В случае КАТ оценивали разложение Н202 по уменьшению поглощения при 240 нм. Активность каждого из ферментов рассчитывали на г сухого веса. За единицу активности принимали изменение оптической плотности на 0.01 ед./мин, вызванное аликвотой фермента [22].
Определение содержания МДА. Содержание МДА определяли методом Dhindsa и Matowe [5]. Клетки (0.5 г) гомогенизировали в 4 мл 0.1% ТХУ (вес/объем). Гомогенат центрифугировали при 15000 g в течение 20 мин. К 500 мкл супернатанта добавляли 500 мкл ТХУ, содержащей 0.5% (вес/объем) тиобарбитуровой кислоты и 50 мкл
140 г
&
о
8^60
£ §40
1
2
3
4
5
Рис. 1. Сырой вес (а) и относительное содержание воды (б) в клетках солодки, подвергнутых водному стрессу и обработанных СаС12. 1 - МС-среда; 2 - МС + 15% ПЭГ; 3 - МС + 15% ПЭГ + + 10 мМ СаС12; 4 - МС + 15% ПЭГ + 40 мМ СаС12; 5 -МС + 40 мМ СаС12.
бутилированного окситолуола в этаноле (4%, вес/объем). Смесь прогревали при 95°С в течение 30 мин и затем быстро охлаждали во льду. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Концентрацию МДА подсчитывали, используя коэффициент экстинкции 155 мМ/см.
Водный потенциал, осмотический потенциал и содержание кальция. Для измерения водного потенциала культуральной среды использовали микровольтметр Wescor ИЯ 33Т ('^езсог", Канада), соединенный с С52 термопарами в камерах психрометра. Для измерения осмотического потенциала в водяном паре с помощью осмометра С^е8СОг") клетки замораживали и раздавливали под гидравлическим прессом. Осмотический потенциал измеряли у контрольных, подвергнутых стрессу, т.е. обезвоженных (у0), и насыщенных водой (у100) клеток. В ус
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.