ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 591.181:612.822.3
КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМАЯ ФОСФАТАЗА КАЛЬЦИНЕЙРИН ТОРМОЗИТ ВЫЗВАННУЮ СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ © 2013 г. А. Е. Гайдуков*, Е. О. Тарасова, О. П. Балезина
Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет,
кафедра физиологии человека и животных
На нервно-мышечных синапсах мыши показано, что ингибирование кальций- и кальмодулин-за-висимой фосфатазы кальцинейрина циклоспорином А или кальцинейрин-ингибирующим пептидом приводит к значительному увеличению квантового состава вызванных потенциалов концевой пластинки (ПКП) в условиях короткого ритмического залпа (50 Гц в течение одной секунды), которое полностью предотвращается нитрендипином (блокатором потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа), или блокированием рианодиновых рецепторов с помощью ТМВ-8 или рианодина. Квантовый состав одиночных ПКП возрастал под действием активатора L-типа кальциевых каналов S(-) Bay K 8644. На этом фоне циклоспорин А оказался не способен вызвать дальнейшее увеличение квантового состава ПКП. Сделано заключение, что активность кальцинейрина при нормальной работе моторных синапсов мыши направлена на торможение вызванной секреции посредством снижения входа кальция по каналам L-типа и сопряженного с ним выброса депонированного кальция через рианодиновые рецепторы.
Ключевые слова: кальцинейрин, вызванная активность, квантовый состав, кальциевые каналы L-типа, рианодиновые рецепторы, циклоспорин А.
Б01: 10.7868/81027813313010032
Кальцинейрин (РР2В) — Са2+-кальмодулин-ак-тивируемая серин-треониновая фосфатаза, первоначально обнаруженная и выделенная из нервной ткани [1], описана в настоящее время практически во всех клетках — от низших эукариот до растений и млекопитающих [2]. Кальцинейрин участвует в регуляторных механизмах, запускаемых изменениями кальциевых сигналов, дефосфорилируя разнообразные эффекторные молекулы. В нейронах и центральных синапсах активность кальци-нейрина как фосфатазы проявляется в контролировании широкого спектра пре- и постсинаптиче-ских процессов — от регуляции работы ионных каналов до долговременных изменений синапти-ческой пластичности [3—7]. В центральной нервной системе кальцинейрин участвует в развитии многих патологических состояний, включая болезнь Альцгеймера [8—10]. В периферических нервно-мышечных синапсах млекопитающих экспрессия и особенности функционирования каль-цинейрина не исследованы. В связи с этим, целью данной работы было обнаружение активности
* Адресат для корреспонденции: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, кафедра физиологии человека и животных, тел. (495) 93927-52, e-mail: gaydukov@gmail.com.
кальцинейрина и специфики его действия в моторных синапсах мыши путем анализа работы синапсов на фоне аппликации избирательных ингибиторов фермента.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование вызванной и спонтанной секреции медиатора в моторных синапсах мыши проводили на изолированных "рассеченных" нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы (m. diaphragma — n. phrenicus) при комнатной температуре (20°С) [11]. Рассечение мышечных волокон не проводилось у препаратов в экспериментах с регистрацией только спонтанной активности моторных синапсов. Левую половину диафрагмаль-ной мышцы с частью диафрагмального нерва помещали в камеру объемом 3 мл и перфузировали оксигенированным (95% O2, 5% CO2) раствором Лайли (pH 7.2—7.4), содержащим (мМ): NaCl — 135, KCl - 4, NaH2PO4 - 0.9, CaCl2 - 2, MgCl2 - 1, NaHCO3 - 16.3, глюкоза - 11. Регистрацию миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) и вызванных потенциалов концевой пластинки (ПКП) осуществляли с помощью внутриклеточных стеклянных микроэлектродов,
35
3*
с 45 * 45
С 40
<ч
св Н О
о о
=s 3 rn
о
я 20
а CQ
* 15
мВ
1.0 I
35 30 25
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 Номер ПКП в залпе
П45 К45
П40
в
S 35
о
о
2 30
Й 25
о
S3 20
а
Кв15
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 Номер ПКП в залпе
Рис. 1. Влияние ингибиторов кальцинейрина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов мыши при короткой высокочастотной стимуляции. Изменение рисунка залпа ПКП при ритмической активности синапсов с частотой 50 Гц в контроле (•), при воздействии 1 мкМ циклоспорина А (О) (а) и на фоне кальцинейрин-ингибирующего пептида 0№12 (□) (б). На врезках — значения амплитуды МПКП. *р < 0.05 по сравнению с контролем.
заполненных 2.5 М KCl (сопротивление кончика 15 МОм). При изучении ритмической активности синапсов стимулировали диафрагмальный нерв короткими пачками сверхпороговых импульсов (50 стимулов длительностью 0.1 мсек с частотой 50 Гц). Одиночные ПКП регистрировали при раздражении нерва с частотой 0.3 Гц (не менее 30 стимулов). Сигналы регистрировали при помощи усилителя Axoclamp-2B (Molecular Devices) и записывали их с помощью аналого-цифрового преобразователя "L-Card Е-154" с интерфейсом "PowerGraph" на жесткий диск компьютера. Полученные данные затем обрабатывали в программе "MiniAnalysis" (Synaptosoft). В каждой серии экспериментов использовали не менее трех нервно-мышечных препаратов, в контроле регистрировали МПКП и ПКП в разных синапсах (не менее 5) и далее в перфузирующий раствор в определенном порядке добавляли исследуемые вещества, и проводили регистрацию синаптической активности от разных синапсов в течение 1—1.5 ч. В работе использовались ингибиторы кальцинейрина — циклоспорин А и кальцинейрин-ингибирующий пептид CN412, блокатор кальциевых каналов нитрен-
дипин, блокаторы рианодиновых рецепторов ТМВ-8 (8-(диэтиламино) октил-3,4,5-триме-токсибензоат) и рианодин (все — Enzo Life Sciences, USA) и активатор кальциевых каналов S(-) Bay K 8644 (Sigma, USA). Помимо определения средних значений амплитуд МПКП и ПКП, производили оценку квантового состава ПКП (его рассчитывали как отношение средней корректированной на нелинейную суммацию амплитуды ПКП к средней амплитуде МПКП) [11]. Достоверность различий между выборками оценивали по ¿-критерию Стьюдента и критерию Манна—Уитни. Уровень значимости отличий между двумя выборками составлял 0.05 (n — количество исследованных синапсов).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ
В первой серии экспериментов проводили ин-гибирование активности кальцинейрина с помощью циклоспорина А (1 мкМ). Аппликация циклоспорина А (CsA) в течение 60 мин не приводила к изменению величины среднего значения мембранного потенциала по сравнению с контролем (-41.00 ± 1.63 мВ (п = 26) и -40.71 ± 1.89 мВ (п = 15), соответственно (р > 0.05)). Под действием CsА амплитуда первого ПКП в залпе возрастала на 33% от 23.84 ± 1.95 в контроле (п = 26) до 31.78 ± ± 2.32 мВ (п = 15, р < 0.05), и это происходило за счет увеличения квантового состава ПКП от 31.91 ± 2.95 в контроле до 37.85 ± 1.82 (р < 0.05) на фоне CsA (рис. 1а). Амплитудно-временные характеристики и частота МПКП достоверно не изменялись. Для более тщательной проверки отсутствия влияния CsA на спонтанную секрецию медиатора была проведена дополнительная серия экспериментов на интактных (нерассеченных) нервно-мышечных препаратах, в которых регистрировали только МПКП в контроле и на фоне СsA. Ни один из анализируемых параметров МПКП — амплитуда, частота, времена нарастания и полуспада — на фоне действия 1 мкМ CsA достоверно не изменялся.
Для подтверждения потенцирующего влияния ингибиторов кальцинейрина на вызванную секрецию в нервно-мышечном синапсе, в следующей серии эффекты CsA были сопоставлены с действием другого избирательного ингибитора кальци-нейрина — кальцинейрин-ингибирующего пептида CN412, представляющего собой последовательность аминокислот аутоингибирующего домена кальцинейрина [12].
Как и в случае с CsA, не было обнаружено каких-либо достоверных изменений параметров спонтанной секреции медиатора ацетилхолина на фоне действия CN412. Так, амплитуда МПКП на фоне действия 2.3 мкМ CN412 (0.96 ± 0.07 мВ, п = 16) не отличалась от контрольного уровня (1.00 ± 0.09 мВ, п = 15, р > 0.05) (рис. 1б, врезка). В
КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМАЯ ФОСФАТАЗА КАЛЬЦИНЕЙРИН
37
то же время на вызванный выброс медиатора в условиях залповой активности синапса CN412 оказывал действие, аналогичное 1 мкМ CsA. Амплитуда первого ПКП в залпе возрастала от 28.06 ± ± 3.55 мВ в контроле (n = 15) до 36.90 ± 3.26 на фоне CN412 (n = 16,p < 0.05) за счет увеличения квантового состава на 36% - от 27.87 ± 1.92 до 38.00 ± 2.46 (p < 0.05), и этот потенцирующий эффект сохранялся на протяжении всего залпа — каждый ПКП в залпе на фоне CN412 был увеличен по сравнению с соответствующим ПКП в контроле (рис. 1б). Сходство эффектов двух разных ингибиторов кальцинейрина позволяет предположить, что в нервных терминалях моторных синапсов присутствует активность кальцинейрина, направленная на торможение квантовой секреции ацетилхолина в условиях вызванной активности синапсов.
Важно было понять возможную направленность, т.е. мишени действия кальцинейрина в моторных терминалях. На разных типах возбудимых клеток показано воздействие кальцинейрина на потенциал-зависимые кальциевые каналы L-ти-па — или напрямую, или же в составе мультифер-ментного регуляторного комплекса с якорными белками [10, 13—15]. Поэтому далее была исследована возможность того, что и в моторных синапсах действие кальцинейрина направлено на торможение работы L-типа кальциевых каналов. С этой целью проводили предварительное блокирование кальциевых каналов L-типа нитрендипином (1 мкМ). Нитрендипин сам по себе достоверно не влиял на спонтанную и вызванную активность синапса, но в его присутствии полностью предотвращалось потенцирующее действие CsА (1 мкМ) на амплитуду и квантовый состав ПКП по ходу ритмического залпа (рис. 2а). Считается, что в нормальных условиях в моторных синапсах млекопитающих пресинаптические кальциевые каналы L-типа не активны или не принимают участия в регуляции экзоцитоза [11, 16—19], но могут быть демаскированы и вовлекаться в регуляцию секреции ацетилхолина под действием их дигидропири-динового активатора S(-) Bay K 8644 [20]. В данных экспериментах аппликация S(-) Bay K 8644 на нервно-мышечный препарат в концентра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.