БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып.. 5, с. 707 - 716
УДК 577.11,579.84,570.83.3
КАПСУЛЬНЫЙ ПОЛИСАХАРИД БАКТЕРИЙ ЛгоБрЬМиш Про/егиш Sp59b: СТРУКТУРА, АНТИГЕННАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ
© 2010 г. О.Н. Смолькина1*, В.В. Качала2, Ю.П. Федоненко1, Г.Л. Бурыгин1, Э.Л. Здоровенко2, Л.Ю. Матора1, С.А. Коннова1,3, В.В. Игнатов1
1 Учреждение РАН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049 Саратов, просп. Энтузиастов, 13; факс: (8452)970-383, электронная почта: room308@ibppm.sgu.ru
2Учреждение РАН Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 47; электронная почта: evelina@ioc.ac.ru
3 Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, 410012 Саратов, ул. Астраханская, 83; электронная почта: konnovasa@info.sgu.ru
Поступила в редакцию 07.05.09 После доработки 16.06.09
Для типового штамма азотфиксирующих ризобактерий Azospirillum lipoferum 8р59Ь с использованием антител, полученных на гомологичный липополисахарид и липополисахарид-белковый комплекс, выявлены антигенные различия между липополисахаридами внешней мембраны клеточной стенки и капсульными высокомолекулярными биогликанами. Из капсульных липополисахарид-белкового и полисахарид-липид-ного комплексов бактерий А. lipoferum 8р59Ь выделены полисахариды, строение которых впервые для азо-спирилл установлено с помощью анализа моносахаридного состава, включающего в себя определение абсолютных конфигураций, анализа методом метилирования, О-дезацетилирования, одномерной и двумерной спектроскопии ЯМР. Показано, что полисахариды исследуемых капсульных комплексов имеют идентичную структуру разветвленного тетрасахаридного повторяющегося звена
Р-Б-О1ор
1 ОАС ~60—65%
I I
3 2
^2)-а-Ь-Мар-(1^3)-а-Ь-КЬар-(1^3)-а-Ь-КЬар-(1^ ,
отличную от структуры О-специфического полисахарида, входящего в состав липополисахарида внешней мембраны этого же штамма.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Azospirillum, капсульные антигены, структура полисахарида.
Грамотрицательные почвенные диазотроф-ные бактерии рода Azospirillum в последние годы активно используются как модельный объект для изучения закономерностей образования и функционирования растительно-микробных
ассоциаций. Несмотря на то что молекулярный механизм взаимодействия остается до конца невыясненным, известно, что прикрепление бактерий к корням растений — необходимый этап формирования эффективной ассоциации. В
Принятые сокращения: КПС — капсульные полисахариды; ЛПС — липополисахарид (О-антиген); ОПС — О-спе-цифический полисахарид; ЛПБК — липополисахарид-белковый комплекс; ПСЛК — полисахарид-липидный комплекс; КДО — 2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота; Ат — антитела; ПС-полисахарид; ДПС — О-дезацетилированный полисахарид; ИФА — иммуноферментный анализ; COSY — корреляционная спектроскопия; TOCSY — полная корреляционная спектроскопия; ROESY — спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат; HMBC — гетероядерная корреляция через несколько связей; HSQC — гетероядерная спектроскопия с одноквантовым переносом когеренции.
* Адресат для корреспонденции.
707
7*
этом процессе существенную роль играют полисахариды, локализованные на поверхности бактериальных клеток [1, 2]. К основным гликопо-лимерам поверхности азоспирилл относятся ли-пополисахариды и капсульные полисахариды (КПС). Липополисахарид (ЛПС, О-антиген) — преобладающий (обязательный) компонент внешней мембраны клеточной стенки грамот-рицательных бактерий — состоит из трех структурно различающихся частей: липида А, корово-го олигосахарида и О-специфического полисахарида (ОПС). Некоторые бактерии способны выделять экзоцеллюлярный ЛПС [3]. О-Антиге-ны играют важную роль во взаимоотношениях бактериальной клетки с окружающей средой. При определенных условиях культивирования микроорганизмов на поверхности клеток образуется капсула — самостоятельный полифункциональный органоид бактериальной клетки, включающий в себя белки и КПС. Эти полимеры могут вызывать иммунный ответ (K-антиге-ны) и, как и ЛПС (О-антиген), определять серо-тип микроорганизмов [4].
В составе капсулы азоспирилл было выявлено наличие двух высокомолекулярных полиса-харидсодержащих соединений, условно названных в соответствии с соотношением компонентов в них липополисахарид-белковым комплексом (ЛПБК) и полисахарид-липидным комплексом (ПСЛК) [2]. В каждом из этих соединений было показано наличие углеводов, 3-гид-роксилированных жирных кислот и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО), характерных и для ЛПС [5]. Это позволяет предположить, что ЛПБК и ПСЛК являются экстраклеточными формами ЛПС по аналогии с первой и четвертой группами классификации капсульных полисахаридов Escherichia coli [6].
Проведенные ранее исследования бактерий A. brasilense Sp7 и Sp245 с использованием антител (Ат), полученных на целые клетки азоспирилл, обработанные глутаровым альдегидом, не выявили антигенных различий между ЛПС из капсульных ЛПБК и О-полисахаридов из ЛПС внешней мембраны [7]. Позже для штамма A. brasilense Cd с использованием поликлональных Ат к очищенным препаратам ЛПС, специфичных к полисахаридной части О-антигена, было показано, что капсула частично экранирует ЛПС внешней мембраны [8]. Таким образом, вопрос о наличии у азоспирилл индивидуальных К-антигенов оставался открытым. Учитывая, что именно КПС в силу их поверхностной локализации опосредуют взаимодействие бактерий с окружающими организмами, а также сведения об их роли во взаимодействии с растительными и бактериальными лектинами [9, 10],
их участии в формировании биопленок [11] и других процессах, важных для выживания микроорганизмов и функционирования в ассоциации с растениями [2, 4, 10], можно констатировать, что отсутствие информации о структуре КПС — существенный пробел в изучении молекулярного механизма ассоциативности.
С использованием кроличьих Ат, полученных после иммунизации препаратами ЛПС и ЛПБК, нам удалось выявить индивидуальные К-антигены у типового штамма A. lipoferum Sp59b, а также впервые для представителей бактерий рода Azospirillum установить химическую структуру ПС, входящих в состав КПС.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали типовой штамм A. lipoferum Sp59b (АТСС 29707, В-1519) из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Микроорганизмы культивировали на жидкой малат-но-солевой среде с витаминами при 30° до окончания экспоненциальной фазы роста [5].
Выделение полисахаридсодержащих полимеров поверхности азоспирилл. С поверхности клеток отмывали капсульный материал 0,15 М NaCl в течение 6 сут с ежедневной заменой отмывающего раствора. ЛПС выделяли из высушенных ацетоном бескапсульных клеток водным фенолом методом Вестфаля, как описано ранее [12]. Выделение из экстракта высокомолекулярной фракции ЛПС проводили гель-фильтрацией на колонке (55 х 1,8 см, V0 = 40 мл) с носителем сефарозой CL-4B («Pharmacia», Швеция). В качестве элюирующего раствора использовали 0,025 М NH4HCO3 (pH 8,3). Выход ЛПС составил 2,6% массы сухих клеток.
Смытый в течение первых двух дней капсуль-ный материал концентрировали, диализовали через мембраны (предел исключения 12—14 кДа) против дистиллированной воды (24 ч), а затем разделяли на фракции ЛПБК и ПСЛК гель-фильтрацией на колонке с сефарозой CL-4B. ЛПБК выходили с холостым объемом колонки, затем следовала фракция ПСЛК. Капсульные комплексы подвергали многократному разделению для получения максимально гомогенных (по данным гель-фильтрации) препаратов. Выходы ЛПБК и ПСЛК составили соответственно 0,3 и 0,1% массы сухих бактериальных клеток.
Деградацию комплексов проводили 2%-ной уксусной кислотой при 100° в течение 5 ч. Образовавшиеся осадки отделяли центрифугированием. Водорастворимую фракцию разделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом G-50 в 0,05 М пиридин-ацетатном буфере (рН 4,5),
контролируя элюцию с помощью дифференциального проточного рефрактометра Knauer. В результате были получены полисахариды с выходами 27,5 и 33,3% массы ЛПБК и ПСЛК соответственно.
Электрофорез препаратов ЛПС и КПС выполняли в 12,5%-ном Ds-Na-ПААГ [13]. Визуализацию компонентов осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотно-кисло-го серебра [14] и кумасси голубым R-250 [15]. При иммуноблоттинге проводили электроперенос разделенных компонентов с ПААГ на нитро-целлюлозные мембраны с диаметром пор 0,2 мкм («Sigma», США) в электрическом поле (при напряжении 60 В) в течение 2 ч. Свободные сайты связывания на мембране блокировали 1%-ным обезжиренным молоком в течение 1 ч. Иммуно-детекцию проводили путем инкубации блотов с поликлональными кроличьими анти-ЛПС Ат [16] и ЛПБК A. lipoferum Sp59b. Для проявления использовали конъюгированную с козьими антикроличьими Ат пероксидазу хрена («Sigma»), 3,3'-диаминобензидин и перекись водорода в качестве субстратного реагента.
Для получения Ат на ЛПБК A. lipoferum Sp59b (АтЛПБК Sp59b) осуществляли иммунизацию кроликов троекратно с двухнедельным интервалом, последовательно вводя в подколенные лимфатические узлы 0,5, 1,0 и 1,5 мг ЛПБК. Раствор ЛПБК предварительно прогревали при 100° в течение 5 мин и центрифугировали. Антиген смешивали в соотношении 1 : 1 при первой иммунизации с полным, а при последующих — с неполным адъювантом Фрейнда. Кровь отбирали через неделю после последней иммунизации. Фракции иммуноглобулинов G получали из антисывороток осаждением сульфатом аммония [17].
Реакцию агглютинации бактериальных клеток проводили в 96-луночных планшетах, как описано в работе [16]. Двойную радиальную им-мунодиффузию препаратов выполняли по стандартной методике [18] в 1%-ном агарозном геле. Преципитат окрашивали красителем кумасси голубым R-250. Твердофазный иммунофермент-ный анализ (ИФА) выполняли в полистироловых 96-луночных планшетах («Медполимер», Россия). По 50 мкл последовательных двукратных разведений образцов (в 0,15 М фосфатно-солевом буфере, pH 7,2) вносили в лунки планшетов. В качестве вторых Ат использовали козьи антикроличьи антитела, конъюгирован-ные с пероксидазой хрена («Sigma»). В качестве субстратного реагента использовали перекись водорода с о-фенилендиамином. Измерения оптического поглощения ис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.