МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 307-311
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.232.017.73:577.152.1
КАРБОАНГИДРАЗА АЛКАЛОФИЛЬНОЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ
М1СЯОСОЬЕи8 СНТНОМОРЬЛЗТЕЗ
© 2004 г. Е. В. Куприянова*, А. Г. Маркелова*, Н. В. Лебедева*, Л. М. Герасименко**, Г. А. Заварзин**, Н. А. Пронина* 1
*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 09.06.03 г.
Исследовали распределение активности карбоангидразы (КА) в различных клеточных фракциях у алкалофильной цианобактерии М1сгоео1еш сЫНвгюр^гез. Активность фермента обнаружена в растворимой и в мембранной фракциях белка, а также в целых интактных клетках и в мощном глико-каликсе, окружающем клетку этой цианобактерии. Локализация КА в гликокаликсе М. сЫНонор^-1е$ подтверждена с помощью Вестерн-блот анализа и иммуноэлектронной микроскопии с антителами к тилакоидной КА CНlamydomoнas гетНагЖп (СаЬЗ). Показано, что по крайней мере одна из форм КА гликокаликса М. cНtНoнoplastes относится к а-типу фермента. Рассмотрен возможный механизм участия КА гликокаликса в кальцификации цианобактерий.
Ключевые слова: алкалофильные цианобактерии содовых водоемов, Microcoleus cНtНoнoplastes, карбоангидразы, гликокаликс, кальцификация.
Основы биосферы современного типа были заложены около 2 млрд. лет назад, в период господства на Земле бактерий [1]. Именно тогда произошла перестройка всей геосферно-биосферной системы, что дало возможность ее формирования в том виде, в каком мы наблюдаем ее в настоящее время. Этапы становления биосферы в настоящее время выяснены в общих чертах геологами и палеонтологами для 3.8 млрд. лет истории Земли, на протяжении которых прослежена геологическая осадочная летопись. Прокариотной биосфере соответствует наличие в осадочных породах строматолитов - слоистых известняковых отложений, представляющих собой литифицирован-ные цианобактериальные сообщества. Таким образом, на ранних этапах эволюции Земли происходил глобальный сток углекислоты, важнейший геохимический механизм, который заключался в связывании углекислоты в карбонаты, прежде всего кальция. Главную роль в этом процессе играли древние цианобактерии, благодаря их способности к кальцификации - связывании неорганического кальция в карбонаты с последующей минерализацией.
Существует мнение [1, 2], что в процессе кальцификации у цианобактерий и эукариотических водорослей может принимать участие фермент карбо-ангидраза (КА, карбонатгидролиаза, КФ 4.2.1.1), который катализирует обратимую реакцию гидратации диоксида углерода по уравнению: (CO2 +
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: npronina@ippras.ru).
+ Н20 -—- НС 03 + Н+) . Наиболее хорошо изученной функцией КА у фотосинтезирующих микроорганизмов является участие этого фермента в С02-концентрирующем механизме [4—7], позволяющем повысить эффективность фотосинтеза путем насыщения рибулезобифосфаткарбокси-лазы (РБФК) его субстратом, диоксидом углерода, при низкой концентрации такового в окружающей среде. Однако все чаще отмечается, что биологическая роль КА может быть значительно шире и разнообразнее. Потенциальные возможности КА видят, прежде всего, в регулировании процессов удаления или поставки субстратов С02
или НС 03, которые используются во многих процессах карбоксилирования и декарбоксилирова-ния, а также в транспорте ионов, сопряженных с транспортом бикарбоната. Кроме того, КА способствует образованию известкового скелета у кораллов [8] и отложению кальциевых чешуек у кокколитофорид [9].
Анализ геномных последовательностей у широкого круга прокариот [10-12] показал, что КА являются очень древними ферментами, существующими еще до разделения Архей и Бактерий. По современной систематике все КА подразделяют на три основных класса (а, в и у), которые не имеют между собой гомологии в аминокислотной последовательности и, как предполагают, появились в ходе эволюции независимо друг от друга [10]. Ферменты у- и Р-классов широко распространены у Бактерий и Архей [10-12]. У позвоноч-
307
2*
Распределение активности карбоангидразы (КА) в клеточных фракциях Microcoleus chthonoplastes
Фракция Активность КА, усл. ед./мг хлорофилла Активность КА, усл. ед./мг белка фракции
Гомогенат 737 ± 53 26 ± 5
Растворимый белок 676 ± 47 48 ± 3
Мембранный белок 56 ± 8 4 ± 1
Интактные клетки 132 ± 6 5 ± 0.2
Гликокаликс - 66 ± 12
ных обнаружен только а-класс КА, включающий 10 изоформ фермента у человека [10]. В клетках цианобактерий обнаруживаются все три класса КА [12]. Можно предполагать, что эти ферменты у древних цианобактерий сыграли важную роль в глобальном стоке углекислоты при образовании строматолитов, произошедшем в докембрийский период. Тем не менее, организация КА системы у представителей реликтовых сообществ до сих пор не исследована. Хотя этот вопрос представляет большой интерес не только для понимания геохимических процессов, происходивших на Земле в далеком прошлом, но и для понимания эволюции трех классов КА.
Целью настоящего исследования являлось изучение активности и локализации КА у обитателя таких сообществ - алкалофильной циано-бактерии Microcoleus chthonoplastes. Внимание в основном уделялось поиску внеклеточной формы фермента, которая может участвовать в кальци-фикации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования использовали алкалофильную цианобактерию Microcoleus chthonoplastes из коллекции Института микробиологии РАН. Культура была выделена из содового озера Хилганта Читинской области [13].
Культуру выращивали в стерильных условиях на щелочной среде S, с содержанием карбонатов 17 г/л [13], pH 9.5-9.8, при температуре 20°C и освещении люминесцентными лампами 30 Вт/м2.
Разрушение клеток проводили в фосфатном буфере следующего состава: 0.06 М Na2HPO4, 5 мМ цистеин, 1 мМ ЭДТА, pH 8.1, на холоду в гомогенизаторе "Retch-MMW" (Германия) со стеклянными бусами при соотношении буфер : бусы -1 : 1. Фракционирование гомогената на фракции растворимых белков и нерастворимых компонентов клетки, содержащих клеточные мембраны, проводили с помощью центрифугирования при 18000 g, 40 мин [14].
Гликокаликс выделяли с помощью фильтрации гомогената через капроновый фильтр. Полученный на фильтре препарат многократно промывали фосфатным буфером для удаления мембран и растворимых белков. В качестве маркера на полноту отделения гликокаликса от клеточного материала использовали содержание хлорофилла в выделенной фракции.
Активность КА определяли электрометрическим способом по изменению концентрации H+ в реакции гидратации диоксида углерода [14] с помощью рН-метра М-901 ("Orion", США). Реакционная смесь объемом 2 мл содержала интактные клетки, отмытые от культуральной среды, суммарный гомогенат или его фракции (0.1-0.5 мг белка) в фосфатном буфере. Реакцию проводили при 2°C и начинали быстрым введением насыщенного раствора CO2 в равный объем реакционной среды. Активность КА рассчитывали в условных единицах Вильбура-Андерсена на мг хлорофилла или на мг белка по изменению начлаьной скорости реакции. Контролем служила неферментативная реакция. Измерение скорости реакций проводили в 3-5-кратной повторности.
Электрофоретическое разделение полипептидов проводили в денатурирующих условиях в 12%-ном геле полиакриламида [3].
Вестерн-блот анализ осуществляли согласно стандартному протоколу Bio-Rad Laboratories. Антитела к КА, кодирующей а-тип КА (Cah3) C. re-inhardtii [6], любезно предоставлены проф. Sam-uelsson (Umea University, Sweden).
Содержание белка определяли по методу Лоури. Содержание хлорофилла измеряли спектрофото-метрически в метанольных экстрактах [3, 14].
Электронно-иммунохимический анализ локализации карбоангидразы в клетках M. chthonoplastes проводили согласно методике, описанной [15]. Для иммуноцитохимической реакции, которую проводили после фиксации материала 4%-ным формалином, использовали те же антитела к а-КА (Cah3) из C. reinhardtii, что и в случае Вестерн-блот анализа, и Protein-A-Gold ("Sigma"). Ультратонкие срезы исследовали на микроскопе JEOL X-100 (Япония) без дополнительного контрастирования.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В суммарном бесклеточном гомогенате M. chthonoplastes обнаружена высокая активность КА (таблица), сопоставимая по значениям с активностью ферментов у эукариотических клеток микроводорослей [7, 11, 12, 16]. Распределение активности КА, рассчитанной на единицу суммарного хлорофилла по фракциям гомогената, показало наличие более высокой активности фермента в растворимой фракции белка по срав-
нению с мембранной фракцией. В расчете на единицу белка выделенной фракции активность мем-браносвязанной КА в клетках M. chthonoplastes составляла всего 8% от активности растворимой КА. Активность фермента обнаружена также в интактных неразрушенных клетках, что свидетельствует о наличии внеклеточных КА, имеющих доступ к наружному субстрату. Особенно высокая активность фермента (в расчете на единицу белка) найдена у M. chthonoplastes в глюкокалик-се (гКА), который образован, главным образом, липополисахаридами, а также содержит около 4.5% белка от суммарного белка клетки.
С помощью Вестерн-блота (рис. 1) общего клеточного гомогената и выделенного препарата гликокаликса из M. chthonoplastes с поликлональ-ными антителами к а-КА (СаИЗ) из C. reinhardtii, показано наличие одной белковой полосы в обоих образцах. Сигнал КА соответствует молекулярной массе около 20 кДа.
Локализация карбонатгидразы в гликокалик-се подтверждена также с помощью метода имму-ноэлектронной микроскопии клеточных срезов и выделенного препарата гликокаликса M. сЫ^по-plastes при использовании тех же антител к а-КА (СаИЗ) из C. геМаЫН (рис. 2). На представленных фотографиях хорошо видны электронно-плотные метки коллоидного золота лишь в окружающем клетку полисахаридном чехле (рис. 2а). В препарате изолированного гликокаликса (рис. 26), который, как видно из рисунка, не содержал остатков тилакоидных мембран или других клеточных структур, также видны многочисленные частицы коллоидного золота, указывающие на присутствие КА. Специфичность иммунохимических реакций подтверждена контрольными вариа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.