научная статья по теме КИНАЗА-3Р ГЛИКОГЕНСИНТЕТАЗЫ ПРИНИМАЕТ УЧАСТИЕ В ПРОЦЕССЕ АКТИВАЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ, ИНДУЦИРОВАННОМ С-РЕАКТИВНЫМ БЕЛКОМ Химия

Текст научной статьи на тему «КИНАЗА-3Р ГЛИКОГЕНСИНТЕТАЗЫ ПРИНИМАЕТ УЧАСТИЕ В ПРОЦЕССЕ АКТИВАЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ, ИНДУЦИРОВАННОМ С-РЕАКТИВНЫМ БЕЛКОМ»

БИОХИМИЯ, 2013, том 78, вып. 8, с. 1165 - 1170

УДК 577.6

КИНАЗА^ ГЛИКОГЕНСИНТЕТАЗЫ ПРИНИМАЕТ УЧАСТИЕ В ПРОЦЕССЕ АКТИВАЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ, ИНДУЦИРОВАННОМ С-РЕАКТИВНЫМ БЕЛКОМ

© 2013 г. Шао-Джун Лиу1, Вей-Хуа Лиу1, Юн Цхонг12, Ши-Минг Лиу12*

1 Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease, 250 Changgang East Road, Guangzhou 510260, PR China; fax: 86(20)3415-3566, E-mail: gzliushiming@126.com

2 Department of Cardiology, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, PR China

Поступила в редакцию 6.02.13 После доработки 11.04.13

С-реактивный белок (CRP) вносит важный вклад в возникновение атеросклероза и является предвестником риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Роль CRP в активации клеток эндотелия (EC) широко изучается, однако индуцируемые этим белком регуляторные пути пока еще не прослежены полностью. В представленной работе было изучено воздействие киназы-3р гликогенсинтетазы (GSK-3ß) на индуцированный CRP процесс активации EC. Мы установили, что CRP снижал активность эндотелиальной NO син-тетазы (eNOS) во время активации клеток эндотелия. Помимо этого, CRP активировал GSK-3ß путем снижения степени ее фосфорилирования по остатку Ser9, а также уменьшал в зависимости от времени инкубации уровень экспрессии белка ß-катенина. Мы также обнаружили, что под действием специфических ингибиторов GSK-3ß (TDZD-8 и SB415286) происходило частичное восстановление активности eNOS и наблюдалась супрессия секреции эндотелиальными клетками белковых факторов адгезии, таких как молекула-1 межклеточной адгезии (ICAM-1) и молекула-1 адгезии васкулярных клеток ((VCAM-1). Полученные нами новые данные служат доказательствами участия GSK-3ß в активации EC.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: GSK-3ß, CRP, eNOS, активация клеток эндотелия, атеросклероз.

Считается, что воспалительная реакция сопровождает все стадии развития атеросклероза, начиная с активации эндотелиальных клеток (EC) и возникновения дисфункции до разрушения неустойчивых тромбоцитов, что в результате приводит к клиническому проявлению болезни. С-реактивный белок (CRP), член семейства пентраксинов, появляется при воспалении и свидетельствует о переходе заболевания в острую стадию. Концентрация циркулирующего в сыворотке CRP отражает уровень воспалительной реакции у каждого отдельного пациента. В многочисленных исследованиях было установлено, что этот белок является главным маркером воспаления и важным предвестником риска развития сердечно-сосудистых заболеваний [1—3]. C-реактивный белок выполняет важную роль в атеросклерозе. Это было подтверждено многочисленными эпидемиологическими наб-

* Адресат для корреспонденции.

людениями, генетическими исследованиями в человеческих популяциях, изучением атеросклероза у экспериментальных животных, а также при клинических обследованиях случайно выбранных пациентов [4].

Проатеросклеротическая функция CRP обусловливается в значительной степени его взаимодействием с клетками эндотелия. С-реактивный белок индуцирует активацию EC, что приводит к снижению активности эндотелиаль-ной NO-синтетазы (eNOS) [5]. Активация EC приводит также к экспрессии цитокинов, ответственных за воспаление, и белковых факторов адгезии, таких как молекула-1 адгезии васкулярных клеток (VCAM-1) и молекула-1 межклеточной адгезии (ICAM-1) [1—3, 6]. Регуляторные пути, опосредующие действие CRP при атеросклерозе, пока не изучены в деталях. В предыдущих исследованиях было установлено, что CRP негативно влияет на активность серин/треонин-специфической протеинкиназы Akt [7—10]. В

представленной работе мы сосредоточили свое внимание на субстрате Akt — полифункциональной киназе-Sß гликогенсинтетазы (GSK-3ß), и на ее роли в активации клеток эндотелия.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

CRP был получен от TriChem Resources; белок диализовали в течение 12 ч против 0,1 M Tris-HCl-буфера pH 7,5, содержащего 0,2 M NaCl, 2 мМ CaCl2. SB415286 («Sigma-Aldrich»), TDZD-8 («EMD Biosciences»). Использовали антитела против фосфо-Akt (Thr308), фосфо-Akt (Ser473), фосфо-GSK^p (Ser9), GSK-3P, фосфо-eNOS (Ser1177) и eNOS («Cell Signaling Technology») и антитела против р-катенина и гли-церальдегид 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) («Santa Cruz Biotechnology»). Набор для имму-ноферментного анализа белков ICAM и VCAM был из фирмы «Bioscience Inc.».

Эксперименты на культуре клеток. Клетки эндотелия коронарной артерии человека (HCAEC) («Cell Applications Inc.») культивировали в ростовой среде-2 для выращивания эндотелия, содержащей ростовые факторы и 10%-ную сыворотку крупного рогатого скота, в соответствии с инструкцией фирмы-производителя («Lonza»). Клетки наращивали до образования монослоя с плотностью 70—80%. Для проведения экспериментов использовали культуру после 5—7 пассажей. Эксперименты проводили на клетках, пре-инкубированных в течение 24 ч в среде без ростовых факторов в присутствии 0,1%-ной фе-тальной сыворотки. Обработку клеток CRP проводили в течение различных интервалов времени. Преинкубацию клеток с ингибиторами GSK-3P (TDZD-8 или SB415286) проводили в течение 30 мин.

Иммуноблоттинг выполняли как описано нами ранее [11]. Клетки HCAEC лизировали в буфере для подготовки образцов для электрофореза по методу Леммли (62,5 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 2%-ный Ds-Na, 10%-ный глицерин, 50 мМ ди-тиотреитол, 0,1%-ный бромфеноловый синий). Полученные белковые образцы разделяли Ds-Na-ПААГ-электрофорезом и переносили белки на поливинилиденфторидные мембраны («GE healthcare»). Мембраны блокировали 5%-ным обезжиренным молоком в течение 1 ч, а затем инкубировали с соответствующими антителами. Мембраны обрабатывали коньюгатами перокси-дазы с вторичными антителами против IgG кролика или мыши («Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.»). Специфические белковые полосы визуализировали с помощью набора для электрохемилюминесценции (ECL) («GE healt-

hcare»). Количественный анализ проводили с использованием программы Image J.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Эндоте-лиальные клетки HCAEC инкубировали в присутствии 50 мкг/мл CRP или CRP в комбинации с TDZD-8 или SB415286 в течение 18 ч. Кондиционную культуральную среду освобождали от клеток центрифугированием и анализировали супернатант методом «сэндвич» ИФА для определения содержания ICAM-1 и VCAM-1 в соответствии с инструкцией фирмы-производителя («Bioscience»).

Статистический анализ. Данные, полученные, по меньшей мере, из трех независимых экспериментов, усредняли с учетом стандартной ошибки и представляли средние значения в виде столбцов на гистограммах. (Все статистические параметры указаны на рисунках.) При сравнении различных групп клеток использовали t-критерий Стьюдента или программу ANOVA. Различия между группами считали достоверными приp < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССДЕЛОВАНИЯ

Дозозависимое воздействие CRP на уровень фосфо^^^ формы eNOS в клетках эндотелия. В предыдущих исследованиях было установлено, что CRP является негативным регулятором активности протеинкиназы Akt [7—10]. Для проверки этого предположения мы, прежде всего, определили количество фосфо-Т^308 и фосфо-Ser473 форм Akt. Для этого HCAEC обрабатывали CRP в концентрации 0—100 мкг/мл и проводили количественный анализ этих фос-фобелков белков в Ds-Na-ПААГ-электрофорезе и иммуноблоттинге. Как было установлено (рис. 1), уровень фосфо-Akt (Thr308) и фосфо-Akt (Ser473) (активированные формы киназы Akt) в клетках снижался дозозависимо от концентрации CRP. Это означало, что активность киназы Akt падала под действием CRP. Поэтому и уровень фосфо-eNOS (Ser1177) (активированная форма eNOS) также постепенно снижался при увеличении концентрации CRP в среде инкубации (рис. 1). Общее количество белка eNOS в клетке при этом не изменялось. Полученные результаты, свидетельствующие об ингибировании активности eNOS под действием CRP, соответствовали опубликованным ранее литературным данным [5].

Зависимое от времени инкубации воздействие CRP на активность GSK-3ß в клетках эндотелия.

Далее мы изучали активность GSK-3ß в клетках эндотелия, активированных под действием CRP. HCAEC инкубировали в течение 0—12 ч в

присутствии CRP, а затем анализировали образцы клеточных лизатов в Ds-Na-ПААГ-электро-форезе и иммуноблоттинге. Как показано на рис. 2, уровень фосфо-GSK^ß (Ser9) снижался в зависимости от времени инкубации клеток с CRP. Это могло свидетельствовать об активации GSK-3ß под действием CRP. Известно, что активированная киназа^ гликогенсинтетазы фос-форилирует ß-катенин и стимулирует его деградацию; уровень экспрессии ß-катенина также отражает уровень активности GSK-3ß in vivo. Из рис. 2 следует, что уровень ß-катенина в клетках

падал под воздействием CRP, а следовательно, С-реактивный белок постепенно в зависимости от времени инкубации активировал GSK-3ß в HCAEC.

Влияние ингибиторов GSK-3ß (TDZD-8 и SB415286) на уровень фосфо-Ser1177 формы eNOS в клетках эндотелия. Далее мы изучали влияние ингибиторов GSK-3ß на уровень фос-фо-eNOS (Ser1177) в клетках HCAEC. Обработка клеток CRP снижала количество фосфо-GSK-3ß (Ser9) и уровень экспрессии ß-катенина (рис. 3). Одновременно и уровень фосфо-eNOS

CRP 0

12,5

25

50

100 (цд/mL)

p-Akt

(Thr308)

p-Akt (Ser473)

p-eNOS (Ser1177)

eNOS

GAPDH

e д

с

CO

h

о

32

CD

100

80

60

40

20

□ p-Akt (Thr308) U p-Akt (Ser473) p-eNOS

* 1*

0 12,5 25 50 100 Цд/mL

Рис. 1. Зависимость между снижением уровня фосфо-Ser1177 формы eNOS в клетках эндотелия и концентрацией CRP в инкубационной среде. HCAEC инкубировали 12 ч в присутствии CRP в концентрации 0—100 мкг/мл. Иммуноблоттинг выполняли с использованием антител против фосфо-Akt (Thr308), фосфо-Akt (Ser473), фосфо-eNOS (Ser1177) и eNOS. GAPDH служила в качестве внутреннего контроля. *p < 0,05 относительно контроля (0 мкг/мл). Каждый эксперимент был выполнен более чем в трех независимых повторах

p-GSK-3ß (Ser9)

GSK-3ß

ß-catenin

GAPDH

0 2 4 6 8 12 h

100

80

e,

д

n a 60

h

c тз 40

о

LL 20

I

1

p-GSK-3ß ß-catenin

*

I* *

l A*

I

2 4 6 8 12 h

Рис. 2. Временная зависимость активации GSK-3ß при инкубации клеток эндотелия с С-реактивным белком. HCAEC инкубировали в присутствии 50 мк

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком