научная статья по теме КИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПЛЕНОК ХИТОЗАНА Химия

Текст научной статьи на тему «КИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПЛЕНОК ХИТОЗАНА»

ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2015, том 34, № 4, с. 35-39

КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ, КАТАЛИЗ

УДК 541.64; 536.7

КИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ПЛЕНОК ХИТОЗАНА

© 2015 г. Е. И. Кулиш*, И. Ф. Туктарова, В. В. Чернова, В. П. Захаров, С. В. Колесов

Башкирский государственный университет, Уфа *Е-таИ: onlyalena@mail.ru Поступила в редакцию 12.03.2014

Изучены кинетические особенности процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов хи-тозана под действием ферментного препарата гиалуронидазы. Установлено, что, несмотря на то, что гидролизу подвергается монолитный пленочный образец, ферментолиз хитозана в этом случае подчиняется тем же закономерностям, что и процесс ферментативного гидролиза хитозана в растворе при малых концентрациях субстрата.

Ключевые слова: хитозан, ферментативный гидролиз, пленки хитозана.

Б01: 10.7868/80207401X15040093

ВВЕДЕНИЕ

Хитин и хитозан являются природными биополимерами, и процессы их синтеза и, безусловно, их деструкции связаны с ферментативными превращениями [1—3]. Именно биоразрушае-мость до обычных для организма веществ — одно из основных среди многочисленных достоинств хитозана, среди которых можно отметить совместимость с тканями организма, бактериостатичность, хорошую способность к сорбции ранеотделяемой жидкости и др. Совокупность этих факторов приводит к тому, что пленочные материалы на основе хитозана представляют большой интерес для использования их в качестве защитных материалов при лечении хирургических, ожоговых и долго незаживающих ран. Способность хитозана к биодеструкци важна по крайне мере с двух сторон. Во-первых, это позволяет исключить крайне болезненную процедуру смены повязок, а во-вторых, продукты гидролиза хитозана проявляют на порядок большую в сравнении с ним биологическую активность [4].

Биодеструкция хитозана протекает как процесс ферментативного гидролиза макроцепей по Р-гликозидным связям. Очевидно, что самыми подходящими из ферментов для осуществления процесса ферментативного гидролиза являются хи-тиназы и хитозаназы, которые приводят к получению олигосахаридов со степенью полимеризации 2—5. Однако в условиях медицинского применения хитозановых материалов их биодеструкция будет осуществляться под действием неспецифических ферментов, поскольку в организме человека от-

сутствуют и хитиназы, и хитозаназы. Ферменты, содержащиеся в биологических жидкостях человеческого организма (например, лизосомальные ферменты или гиалуронидаза, присутствующие на раневой поверхности), действительно проявляют каталитическую активность по отношению к хитозану [5—8].

Вид материала (например, раствор, гель, пленка) при этом должен определять особенности кинетики данного процесса, поскольку с топохими-ческой точки зрения существует принципиальная разница между доступностью фермента для взаимодействия со звеньями полимера в растворе и их доступностью в монолитном образце. Изучение кинетических закономерностей процесса ферментативного гидролиза в конечном счете приводит к прогнозированию времени жизни полимера в соответствующих условиях функционирования [8]. И если закономерности процесса биодеструкции хитозана в растворе достаточно хорошо изучены [6, 7, 9—12], вопрос об особенностях ферментативного гидролиза монолитных (пленочных) образцов остается практически открытым, что и определило цель данной работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для исследования использовали образец хитозана (ХТЗ) производства ЗАО "Биопрогресс" (Щелково, Россия) с молекулярной массой М = 113000. В качестве ферментного препарата использовали гиалуронидазу ("Лираза") производства ЗАО "Микроген" (Москва, Россия). Содержание фер-

35

3*

36

КУЛИШ и др.

ментного препарата во всех экспериментах составляло 3 • 10-3 г. В качестве растворителя использована 1%-ная уксусная кислота. Концентрация хитозана в растворе при проведении процесса ферментативного гидролиза (С^) варьировалась от 0.15 до 5 г/дл. Объем раствора ХТЗ, взятого для проведения ферментативного гидролиза, составлял 10 мл.

В экспериментах по определению значений характеристической вязкости ХТЗ в ходе ферментативного гидролиза, [п](, раствор с концентрацией СНуа [г/дл] в уксусной кислоте, к которому был добавлен раствор ферментного препарата, выдерживали в течение определенного времени при температуре 36°С, после чего процесс ферментативного гидролиза останавливали посредством кипячения исходного раствора в течение 30 мин на водяной бане. Далее из раствора исходной концентрации СНуа готовили путем разведения раствор с концентрацией С = 0.15 г/дл для определения характеристической вязкости.

Характеристическую вязкость как исходного ХТЗ в растворе уксусной кислоты [п]0, так и хито-зана после выдержки с раствором ферментного препарата (подвергнутого процессу ферментативного гидролиза) определяли с помощью вискозиметра Убеллоде, используя метод, основанный на подходе Иржака и Баранова [13], позволяющем исключить влияние эффекта полиэлектролитного набухания при определении вязкости [14]:

[п]* = д 1п п г/д с,

где цг — значение относительной вязкости ХТЗ, с — концентрация ХТЗ в растворе. Наклоны касательных к зависимостям относительной вязкости от концентрации полимера в растворе (рис. 1) соответствуют значениям "текущей" характеристической вязкости. При с ^ 0 значение [п]* соответствует начальному наклону зависимости \пцг от с и совпадает с характеристической вязкостью полимера в растворе, [п].

Для используемого в работе раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте значение исходной характеристической вязкости образца, не подвергнутого ферментативному гидролизу, составляло [п]0 = 7.8 дл/г. Погрешность эксперимента при доверительной вероятности 0.95 и пяти повторных опытах не превышает 3%.

Для всех использованных концентраций хитозана при небольших временах гидролиза (30— 40 мин) зависимости уменьшения характеристической вязкости от времени имели линейный характер. Именно на этом участке определяли значение начальной скорости ферментативного гидролиза У0, которое рассчитывали по формуле [15]

2 -

1 -

у _ сшк1 /а([п ] г " - [ п ] Г " ) у° - 1 ,

-1/а

-,-1/ач

(1)

0.8 1.2 с • 102, г/см3

Рис. 1. Зависимость относительной вязкости от содержания хитозана в растворе в полулогарифмических координатах.

где ? — время гидролиза, мин; К и а — константы в уравнении Марка—Куна—Хаувинка.

Для определения констант К и а, необходимых для вычисления значений начальной скорости ферментативного гидролиза по уравнению (1) в 1%-ной уксусной кислоте, образец исходного хи-тозана был расфракционирован на 10 фракций в диапазоне значений молекулярных масс от 20 000 до 150000 Да. Абсолютное значение молекулярных масс фракций хитозана было определено посредством сочетания методов скоростной седиментации и диффузии. Значение констант в уравнении Марка—Куна—Хаувинка для используемого раствора хитозана в 1%-ной уксусной кислоте, составило а = 1.02 и К = 5.57 • 10-5.

Пленки хитозана получали методом полива 2%-ного раствора хитозана на поверхность стекла в чашке Петри. Для изучения процесса ферментативного гидролиза из пленки по шаблонам вырезали образцы с линейными размерами а и Ь, величины которых составляли 0.5 х 0.5 см, 0.5 х 1.0 см, 1.0 х 1.0 см, 1.0 х 1.5 см. Толщину пленок поддерживали постоянной и равной 100 мкм. Точный объем пленочного образца рассчитывали, исходя из значений массы и плотности пленки. Плотность пленочного образца хитозана, полученного из 1%-ной уксусной кислоты, определяли пикно-метрическим методом. Для изучаемого нами образца хитозана она составила р = (1.37 ± 0.03) г/см3.

Для проведения эксперимента, моделирующего процесс ферментативного гидролиза хитозана на раневой поверхности, пленочный образец хи-тозана помещали на подложку, смоченную рас-

0

твором ферментного препарата в 1%-ной уксусной кислоте, и выдерживали в течение определенного времени при постоянной температуре (36°C). Объем раствора ферментного препарата (0.05 мл) выбирали, исходя из условия, чтобы только одна из поверхностей пленки соприкасалась с раствором фермента. После выдержки процесс ферментативного гидролиза останавливали путем дезактивации фермента при кипячении его в течение 30 мин на водяной бане. Далее пленку растворяли в 1%-ной уксусной кислоте и определяли текущее значение характеристической вязкости полимера [n]t методом, аналогичным описанному выше для растворов хитозана. Структуру поверхности пленок оценивали методом лазерной сканирующей микроскопии на приборе LSM-5-Exciter (Carl Zeiss, Germany).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При изучении ферментативного гидролиза хитозана задача определения скорости процесса сводится к определению изменений во времени значений характеристической вязкости полимера, происходящих вследствие разрыва макроцепей хитозана при его взаимодействии с ферментным препаратом. Зависимости изменения характеристической вязкости от времени при деструкции пленочного образца и растворов хитозана различной концентрации представлены на рис. 2.

Как видно из данных рис. 2, как в случае пленки, так и в случае растворов хитозана увеличение времени контакта хитозана с ферментом сопровождается уменьшением характеристической вязкости, что свидетельствует об уменьшении молекулярной массы хитозана. При этом в обоих случаях зависимости линейны на начальном этапе реакции. Особенно обращает на себя внимание близкий вид кинетических зависимостей для пленок и растворов, хотя с топохимической точки зрения эти реакции существенно различны. При деструкции в растворе можно в первом приближении принять равновероятной доступность любой гликозидной связи любой цепи для реакции с ферментом. Для пленочных образцов такая реакция возможна только для звеньев, расположенных на поверхности пленки, контактирующей с раствором фермента.

В случае раствора наблюдаемые зависимости начальной скорости ферментативного гидролиза, рассчитанные по уравнению (1), от концентрации хитозана в растворе (рис. 3) хорошо описываются в рамках схемы Михаэлиса—Мэнтен. Значение константы Михаэлиса, КМ, определенное графическим методом Лайнуивера—Берка [16], составило 3.4

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком