КИНЕТИКА И КАТАЛИЗ, 2015, том 56, № 1, с. 48-53
УДК 544.4:542.943.8:615.32
КИНЕТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИОКСИДАНТОВ РЯДА ПИЩЕВЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ СО СТАБИЛЬНЫМ РАДИКАЛОМ 2,2-ДИФЕНИЛ-1-ПИКРИЛГИДРАЗИЛОМ
© 2015 г. В. А. Волков*, В. М. Мисин
ФГБУНИнститут биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва *Е-таИ: vl.volkov@mail.ru Поступила в редакцию 11.12.2013 г.
Спектрофотометрическим методом изучен ход кинетических кривых и изменение скорости реакции антиоксидантов, содержащихся в экстрактах ряда пищевых и лекарственных растений, а также некоторых индивидуальных природных фенольных антиоксидантов со стабильным радикалом 2,2-дифе-нил-1-пикрилгидразилом при различных концентрациях хлороводорода в среде этанола. Проведена оценка вклада различных механизмов в кинетику этих процессов. Обоснован выбор оптимальных концентраций хлороводорода (3—10 ммоль/л), которые облегчают сопоставление кинетических параметров, полученных при изучении различных объектов. Проведено исследование сравнительной антирадикальной активности антиоксидантов на примере сложных образцов, полученных из пищевых и лекарственных растений.
DOI: 10.7868/S045388111501013X
Стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрил-гидразил (ДФПГ) часто используется в исследовательской практике для определения количества антирадикальных антиоксидантов (АО), содержащихся в различных объектах [1—6]. Преимуществами метода являются высокая воспроизводимость результатов, селективность по отношению к антирадикальным АО, высокая чувствительность и доступность необходимого оборудования.
В ряде работ [7—10] было обнаружено близкое совпадение результатов количественного анализа содержания АО в различных объектах методом, основанным на реакции АО с ДФПГ, и иными методами.
В научной литературе обсуждаются различные механизмы взаимодействия АО с ДФПГ и другими радикалами [11—16]: радикальный — HAT (hydrogen atom transfer) и его разновидность PCET (proton coupling electron transfer), а также ионные механизмы — SPLET (sequential proton loss — electron transfer) и ET—PT (electron transfer — proton transfer). При этом ряд исследователей, признавая существование механизма SPLET, отрицают существование ET—PT и наоборот.
Реакция по радикальному механизму HAT, основанному на гомолитическом отрыве атома водорода от молекулы АО
ArOH + ДФПГ* ^ ArO* + ДФПГ-H, (I)
протекает с наибольшей скоростью в неполярных растворителях.
Ионные механизмы и соотношение их вкладов в скорость взаимодействия радикалов с антиок-сидантами в различных реакционных средах будут подробно рассмотрены ниже.
В работе [17] был предложен кинетический метод определения сравнительной реакционной способности по отношению к ДФПГ антиоксидантов, содержащихся в многокомпонентных системах растительного происхождения. При использовании этого метода реакцию проводят в среде 0.1 мМ раствора HCl в этаноле, что обеспечивает значительное замедление процесса вследствие подавления механизма SPLET [14], который не реализуется при ингибировании цепного перекисного окисления липидов в гидрофобной фазе. Введение кислоты в реакционную систему исключает также возможность непредсказуемого влияния органических кислот, присутствующих в объектах растительного происхождения. Кроме того, различия величин pKa фенольных АО не влияют на кинетику процесса, так что скорость реакции зависит в основном от энергии диссоциации ОН-связи фенолов. В дальнейших исследованиях были получены экспериментальные свидетельства того, что при проведении реакции ДФПГ с экстрактивными веществами некоторых пищевых растений при концентрации хлороводорода 0.1—1 ммоль/л механизм SPLET подавляется не полностью.
В настоящей работе была поставлена задача детального анализа кинетики рассматриваемых реакций на примере взаимодействия антиокси-
Таблица 1. Антирадикальная активность антиоксидантов в спиртовых экстрактах некоторых пищевых и лекарственных растений при концентрации HCl 3.3 ммоль/л
Источник АО w0 х 108, моль л 1 с 1 кэф, л моль 1 с 1
Лимон (мякоть плодов) 13.0 260
Апельсин (мякоть плодов) 11.0 220
Грейпфрут (мякоть плодов) 9.1 190
Лук (луковицы) 10.0 210
Чеснок (луковицы) 4.0 81
Пижма обыкновенная (листья) 5.0 100
Чай "Каркаде" 24.0 500
Яблоко (сорт "Гольден") 11.5 230
Виноград красный (плоды) 7.5 150
Примечание. [ДФПГ]0 = 6.5 х 10-5 моль/л, [АО]0 = IC50, T = 293 K.
Таблица 2. Антирадикальная активность антиоксидантов в спиртовых экстрактах некоторых пищевых и лекарственных растений при концентрации HCl 0.1 ммоль/л
Источник АО w0 х 108, моль л 1 с 1 кэф, л моль 1 с 1
Мята перечная 2.0 41
Зверобой продырявленный 2.1 43
Мелисса лекарственная 2.4 49
Тысячелистник обыкновенный 2.3 48
Ромашка аптечная 2.6 53
Пижма обыкновенная 2.0 41
Чай "Каркаде" 12.0 250
Яблоко (сорт "Гольден") 5.0 100
Виноград красный 4.3 87
Примечание. [ДФПГ]0 = 6.5 х 10-5 моль/л, [АО]0 = IC50, T = 293 K.
дантов ряда пищевых и лекарственных растений со стабильным радикалом ДФПГ и интерпретации кинетических закономерностей с учетом существования различных механизмов реакции.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве исследуемых объектов были использованы водные и спиртовые экстракты пищевых и лекарственных растений (табл. 1 и 2), а также широко распространенные в растительном мире индивидуальные фенольные АО — рутин ("Roth") и галловая кислота ("Serva"). Этиловый спирт (азеотропную смесь с водой) подвергали очистке посредством перегонки с дефлегматором. Экстракцию этиловым спиртом, водой или их смесью проводили в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Предварительно исследуемые объекты (яблоки, луковицы лука и чеснока) измельчали. Из мякоти цитрусовых ме-
ханически отжимали сок, после чего дополнительно из оставшейся части экстрагировали АО.
Для записи кинетических кривых и определения начальной скорости реакции в выбранных стандартных условиях взаимодействие экстрактивных веществ, содержащихся в анализируемых объектах, со стабильным радикалом ДФПГ проводили в среде этанола согласно методике [18]. Начальные концентрации смешиваемых реагентов составляли: [ДФПГ]0 = 6.5 х 10-5 моль/л, [АО]0 = /С50, где 1С50 — начальная концентрация АО, при которой глубина превращения радикала в опыте без введения кислоты в реакционную среду достигает 50% через 30 мин после смешивания реагентов. Это соответствует 7.5 х 10-6 моль/л кверцетина [19]. Раствор хлороводорода в 96%-ном этаноле добавляли в необходимом количестве в исследуемый образец, после чего вводили раствор ДФПГ. Температуру реакционной системы в кювете спектрофотометра поддерживали на
w0 х 108, моль л 1 с 1 300
200
100 -
0 -
0 2 4 6 8 10
Снс1, ммоль/л
Рис. 1. Зависимость начальной скорости взаимодействия радикала ДФПГ в среде этанола (азеотропная смесь с водой) с антиоксидантами, содержащимися в экстракте листьев пижмы обыкновенной, от концен-
трации HCl. [ДФПГ]0 = 6.5 х 10 = IC50, T = 293 K.
-5
моль/л, [АО]0 =
уровне 20 ± 0.5°С с помощью термостатируемого кюветодержателя. Кривую падения оптической плотности раствора ДФПГ при X = 517 нм начинали записывать сразу же после смешивания. Начальную скорость реакции w0, являющуюся искомым кинетическим параметром, рассчитывали по программе "Microcal Origin 6.0" с учетом промежутка времени от момента смешивания реагентов до начала регистрации сигнала прибором. Все анализируемые кинетические кривые с высокой точностью (r2 = 99.9) описываются уравнением
-Рдфпг = + ^1exp(-i/fl-1) + A2exp(-i/a-2), (1)
где £дФПГ — оптическая плотность раствора при X = 517 нм, t — время от начала реакции, величины Dx, A1, A2, a1, a2 — параметры, подбираемые самой программой (буквенные обозначения изменены с учетом их физического смысла). Поэтому
W0 = (Ax/ax + ^2/0-2)6 ДФПГ,
к
Wo
эфф (7.515 X 10-6)[ДФПГ]'
(3)
w0 х 109, моль л 6.0
(а) -1
(б)
w0 х 109, моль л 1 с 1 3.5
3.0
0.2 0.3
Chci, моль/л
2.5
2.0
1.5
1.0
0.1
0.2
0.3 0.4 Chci, моль/л
(2)
где 6дфпг = (1.5 ± 0.02) х 104 моль-1 см-1 — молярный коэффициент экстинкции ДФПГ в этаноле [20]. Соотношение предэкспоненциальных множителей А1/А2 характеризует количественное отношение более активных и менее активных АО.
Эффективная (кажущаяся) константа скорости взаимодействия АО исследуемого объекта с ДФПГ в начальный момент времени в пересчете на стехиометрию кверцетина равна
Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции радикала ДФПГ с рутином (а) и галловой кислотой (б) в концентрации 10-5 моль/л в среде этанола (азеотропная смесь с водой) от концентрации HCl. [ДФПГ]о = = 6.5 х 10-5 моль/л, T = 293 K.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследования кинетики взаимодействия антирадикальных АО некоторых пищевых и лекарственных растений, а также индивидуальных фенольных АО (рутина и галловой кислоты) со стабильным радикалом ДФПГ в различных реакционных средах представлены на рис. 1—4. В некоторых средах при последовательном увеличении концентрации хлороводорода скорость реакции вначале резко уменьшается, после чего начинается ее повышение. Минимальная начальная скорость взаимодействия АО экстракта листьев пижмы обыкновенной с ДФПГ наблюдается при концентрации хлороводорода в реакционной среде 0.1 ммоль/л (рис. 1). При той же концентрации HCl достигается и минимум скорости реак-
с
0
w0 х 108, моль л 1 с 1 400
300
(а)
D, отн. ед.
200
100
w0 х 108, моль л 1 с 1 150
120 90 60 30 0
(б)
8 12 ChcI, моль/л
1 „-1
8 (в)
12 16 ChcI, моль/л
w0 х 108, моль л 1 с
30
20
10
150
300
450 Время, с
Рис. 4. Уменьшение оптической плотности раствора ДФПГ при его взаимодействии с антиоксидантами плодов апельсина в среде этанола (азеотропная смесь с водой) в присутствии хлороводородной кислоты с концентрацией, ммоль/л: 1 — 0.1, 2 — 0.33, 3 — 1, 4 — 3.3, 5 - 10, 6 - 30, 7 - 100. [ДФПГ]0 =6.5 х 10-5 моль/л, [АО]0 = 1С50, Т = 293 К.
ствуют с ДФПГ с минимальной скоростью при концентрации хлороводорода в этаноле от 3 до 10 ммоль/л. При проведении реакции ДФПГ с АО плодов апельсина 0.1 мМ раствор HCl в этаноле ингибирует реакцию по механизму SPLET настолько слабо, что записать начальный участок кинетической кривой (рис. 4, кри
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.