ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 452, № 2, с. 230-232
КЛЕТОЧНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ
УДК 612.036.576.314.547.915.5
КЛЕТОЧНАЯ СМЕРТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ L-929, ИНДУЦИРОВАННАЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ БЕЛКОВЫМ КОМПЛЕКСОМ Tag7-Hsp70, АНАЛОГИЧНА ГИБЕЛИ ЭТИХ ЖЕ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ TNF-a
© 2013 г. А. А. Шелудченков, О. Д. Кабанова, Л. П. Сащенко, Е. А. Романова, член-корреспондент РАН Н. В. Гнучев, Д. В. Яшин
Поступило 05.06.2013 г.
БО1: 10.7868/80869565213270261
Поиск новых цитотоксических препаратов, а также понимание механизмов гибели опухолевых клеток при действии этих препаратов и цитотоксических клеток иммунной системы чрезвычайно важны для развития новых стратегий опухольспе-цифической иммунотерапии. В данной работе мы сравнили механизмы цитотоксичности открытого в нашей лаборатории белкового комплекса Tag7-Hsp70 и хорошо изученного цитокина TNF-a и показали сходство в их цитотоксиче-ском действии.
Первыми охарактеризованными и интенсивно исследуемыми природными цитотоксическими факторами были фактор некроза опухоли альфа (TNF-a) и лимфотоксин (LT) [1, 2], впоследствии объединенные в суперсемейство TNF (tumor necrosis factor superfamily; TNFSF), к настоящему времени насчитывающее около 50 мембранных и растворимых белков [3]. Белки суперсемейства TNF осуществляют свою функциональную активность посредством взаимодействия с рецепторами на клеточной поверхности. Эти рецепторы, в свою очередь, объединены в суперсемейство TNFR (tumor necrosis factor receptor superfamily; TNFRSF), представленное на сегодняшний день 23 рецепторами [4]. Внутри этого суперсемейства существует подкласс, именуемый рецепторами смерти. Отличительная черта этих рецепторов — наличие цитоплазматического домена, участвующего в передаче цитотоксического сигнала и носящего название домен смерти (DD) [5—7].
Долгое время считалось, что взаимодействие лигандов с этими рецепторами может индуцировать только апоптоз, поскольку было известно, что DD способен связываться с белками, активирующими специфические протеазы — каспазы, —
Институт биологии гена Российской Академии наук, Москва
инициирующие в дальнейшем апоптотический сигнальный каскад. Однако в 2005 г. было обнаружено, что DD может также активировать белки, запускающие некроптоз, одну из разновидностей запрограммированного некроза. Таким образом, один и тот же рецептор может активировать в клетках два альтернативных механизма клеточной смерти. Эти механизмы не могут быть индуцированы одновременно: активация каспаз блокирует некроптоз, так как каспаза-8 расщепляет протеинкиназы RIP1 и RIP3, инициирующие проведение сигнала некроптоза. Блокирование каспаз, генетическое или при добавлении каспаз-ных ингибиторов, приводит к активации RIP1 и RIP3 и осуществлению программы некроптоза [8].
Ранее в нашей лаборатории показали, что белок врожденного иммунитета Tag7 (PGRP-S/PGLYRP1) может образовывать с белком теплового шока Hsp70 стабильный эквимолярный комплекс, обладающий цитотоксическим действием на ряд культур опухолевых клеток [9]. Этот же комплекс выделяется цитотоксическими лимфоцитами и подавляет рост опухолей, трансплантируемых мышам [10]. Однако конкретные механизмы, приводящие раковые клетки к гибели под действием этого комплекса, пока не выяснены.
Цель настоящей работы — сравнение гибели опухолевых клеток линии L-929, индуцированной белковым комплексом Tag7-Hsp70, с гибелью этих же клеток под действием классического ци-токина TNF-a, для которого известны структура рецептора смерти и механизмы, осуществляющие апоптоз и некроптоз.
В работе мы использовали рекомбинантный человеческий TNF-a (recombinant human TNF-a; r-hTNF-a) (" Sigma-Aldrich", США), комплекс Tag7-Hsp70 получали, инкубируя r-hTag7 и r-hHsp70 в течение 1 ч при 37°C, как описано в [9].
КЛЕТОЧНАЯ СМЕРТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ L-929
231
Цитотоксичность, %
Рис. 1. Цитотоксическое действие ТЫР-а и Tag7-№р70 на опухолевые клетки. Каждый из цитотокси-ческих белковых агентов ТЫР-а и комплекс Tag7-№р70 инкубировали в течение 20 ч с клеточными линиями Ь-929, Jurkat и НеЬа, после чего определяли цитотоксическую активность, как описано в [9].
Цитотоксичность, %
Время, ч
Рис. 2. Динамика цитотоксического действия TNF-а и Tag7-Hsp70 на клетки L-929. Клетки опухолевой линии L-929 инкубировали с цитокином TNF-а или с белковым комплексом Tag7-Hsp70 в течение 24 ч, через одинаковые промежутки времени подсчитывали цитотоксическую активность для каждого из агентов.
Культивирование клеток опухолевых линий Ь-929 (мышиная фибросаркома), Jurkаt (человеческая лимфобластома) и НеЬа (рак шейки матки человека) проводили в среде ЭМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С, 5% С02 и 95%-й влажности; цитотоксическую активность определяли методом подсчета мертвых клеток, окрашенных трипановым синим, как описано в [9].
Исследование гибели в популяциях различных опухолевых клеточных линий под действием каждого из двух цитотоксических агентов, белкового комплекса Tag7-Hsp70 и цитокина ТЫР-а, через 20 ч их инкубации с клетками выявило одинаковую специфичность этих белковых агентов в отношении клеток-мишеней (КМ). На рис. 1 можно видеть, что из представленных КМ клетки НеЬа практически нечувствительны ни к действию комплекса Tag7-Hsp70, ни к действию ТЫБ-а, в то время как Ь-929 и Jurkat являются хорошими мишенями для исследуемых агентов, при этом оба белковых фактора проявляли примерно одинаковую цитотоксичность в отношении КМ. Однако цитотоксичность и в случае ТЫБ-а, и в случае Tag7-Hsp70 не превышала 30%, что, видимо, связано с гетерогенностью клеточных линий и появлением субпопуляций клеток, в которых заблокировано проведение цитотоксических сигналов. Способность опухолевых клеток избегать иммунного контроля широко обсуждается в литературе [9, 11]. Существует много механизмов "им-муноускользания", к которым относятся как потеря поверхностных рецепторов, так и функциональных белков, осуществляющих клеточную гибель.
Далее мы исследовали лизис клеток Ь-929 под действием Tag7-Hsp70 во временном интервале от
1 до 24 ч и сравнили его с лизисом тех же клеток под действием ТЫЬ-а (рис. 2). Кривая зависимости цитотоксической активности от времени инкубации белкового агента с клетками в обоих случаях не имеет линейного характера и не достигает насыщения, а характеризуется двумя максимумами. Первый максимум был зарегистрирован через 3 ч, второй — через 20 ч. Дискретность цитотоксичности и резко отличающиеся скорости цитолиза можно объяснить индукцией разных механизмов цито-токсичности в различных клетках в составе гетерогенной популяции.
Известно, что ТЫЬ-а вызывает быстро протекающий апоптоз в клетках с неповрежденной апоптотической машинерией, а в клетках, в которых благодаря мутациям заблокирована каспаз-ная активность, индуцирует некроптоз, развивающийся более длительное время. Мы видим, что в популяции присутствуют клетки, погибающие под действием ТЫЬ-а с различной скоростью, и можно предположить, что эти клетки гибнут по пути апоптоза (3 ч) и некроптоза (20 ч).
Для проверки этого предположения мы исследовали гибель клеток Ь-929 под действием ТЫЬ-а через 3 ч и через 20 ч в присутствии ингибитора каспаз широкого спектра действия YVAD-CHO (рис. 3а). Можно видеть, что ингибитор полностью подавлял цитотоксическую активность ТЫЬ-а через 3 ч, что подтверждает развитие апо-птоза в этих клетках в этом временном интервале. Также можно видеть, что YVAD-CHO не только не подавлял цитотоксичность ТЫЬ-а через 20 ч, а, наоборот, увеличивал число мертвых клеток, то есть клетки, ранее погибавшие по пути апоптоза, после подавления каспазной активности стали погибать по пути некроптоза. Эти результаты на-
232
ШЕЛУДЧЕНКОВ и др.
□ без ингибитора
□ c YVAD-CHO
Цитотоксичность, % 45
40
35
30
25
20
15
10
5
(а)
Цитотоксичность, % 45
3 ч
20 ч
40 35 30 25 20 15 10 5
J 0
(б)
□ без ингибитора
□ c YVAD-CHO
3 ч
20 ч
Рис. 3. Цитотоксическое действие ТЫР-а и Tag7-Hsp70 на клетки Ь-929 в условиях предварительной инкубации с ингибитором каспаз. Клетки опухолевой линии Ь-929 преинкубировали с каспазным ингибитором УУАО-СНО в концентрации 10—3 М в течение 1 ч, затем добавляли цитокин ТЫР-а (а) или белковый комплекс Tag7-Hsp70 (б). Цито-токсическую активность определяли через 3 ч и через 20 ч.
0
ходятся в полном соответствии с литературными данными и пониманием цитотоксического действия ТЫБ-а на клетки.
Аналогичный эксперимент был проведен и для Tag7-Hsp70 (рис. 3б). Интересно, что данные на рис. 3б полностью воспроизводят данные рис. 3а. Как и в случае с ТЫБ-а, в клетках Ь-929 цитотоксичность под действием Tag7-Hsp70 в присутствии ингибитора каспаз полностью блокируется через 3 ч и возрастает через 20 ч. При этом прирост количества мертвых клеток через 20 ч практически равен снижению их числа через 3 ч инкубации с Tag7-Hsp70. Это дает нам основания полагать, что и в этом случае подавление апоптоза может приводить к запуску некроптоза. Связь между резким снижением количества мертвых клеток через 3 ч и его повышением через 20 ч позволяет предположить, что комплекс Tag7-Hsp70 взаимодействует с одним рецептором клеточной поверхности и индуцирует два альтернативных механизма цитотоксичности.
Возможно, в суперсемействе рецепторов смерти имеется рецептор с известной структурой, для которого белковый комплекс Tag7-Hsp70 является ли-гандом. Не исключено, что комплекс Tag7-Hsp70 может быть лигандом для рецептора ТЫР-Я1. Выяснению этих вопросов будут посвящены ближайшие исследования.
Работа была поддержана грантом РФФИ (№ 12-04—01672-а), программой "Молекулярная
и клеточная биология" и Международным центром генетической инженерии и биотехнологии. Эксперименты были проведены с использованием оборудования ЦКП ИБГ РАН при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт № 16.552.11.7067).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kolb W.P., Granger G.A. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1968. V. 61. № 4. P. 1250-1255.
2. CarswellE.A., Old L.J., KasselR.L., et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V 72. № 9. P. 3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.