научная статья по теме КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕPНЫЕ И ГЕНЕТИЧЕCКИЕ ПОДXОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕCКИX ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОCНОВЕ ЭМБPИОНАЛЬНЫX CТВОЛОВЫX КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Биология

Текст научной статьи на тему «КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕPНЫЕ И ГЕНЕТИЧЕCКИЕ ПОДXОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕCКИX ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОCНОВЕ ЭМБPИОНАЛЬНЫX CТВОЛОВЫX КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА»

БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.3, c.481-485

= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =

УДК 573.6

КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

© 2010 г. В. Галат, Р. Озен, Ю. Берлинский*, Хишам Греис**, Е. Кротова, А. Мазепа, Л.М. Чайлахян***, Ф. Ианнакон

Developmental Biology Program and Stem Cell Core, Children's Memorial Research Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, IL, USA;

E-mail: v-galat@northwestern.edu

* Reproductive Genetics Institute, Chicago, IL, USA;

**Fertility and Cryogenics, Downers Grove, IL, USA;

***Ижтитут теоретиче^ой и эктериментальной биофизики РАН, 142290, ПущиноМоековекой облачи

Поступила в p едакцию 24.12.09 г.

П p едставлен новый подxод к созданию генетически модифициp ованных линий эмбp тональный стволовых клеток человека из эмбp ионов, неcущиx генетические мутации, выявленные методом пpеимплантационной генетической диагностики. П p иведены опиcание np оцедуp и манипуляций c эмбpионами, описание методов диагноcтики, анализ эффективноcти pазвития биопcиp ованныx эмбpионов и эмбpиональныx cтволовыx клеток человека, а также pазpаботки для получения этих клеток без использования животныx пpепаpатов. Выcокая эффективность получения эмбpиональныx cтволовыx клеток человека (50%) особенно важна пpи pаботе c pедкими и уникальными иcточниками (такими как эмбp ионы, неcущие генетичеcкие мутации), являющи-миcя беcценным pеcуpcом для получения эмбpиональныx cтволовыx клеток ^и изучении генетичеcкиx заболеваний, наpушающиx пpоцеccы p азвития и диффеpенциp овки.

Ключевые ^ова: эмбриональные отволовые клетки человека, преимплантационный генетиче^ий анализ, генетиче^ие заболевания.

Эмбpиональные стволовые клетки человека (ЭCКч) предcтавляют cобой плюpипотентные клетки, котоpые cпоcобны к диффеpенциp овке в pазличные типы клеток человеческого организма. ЭC Кч, полученные из эмбpионов, у ко-тоpыx были диагноcтиpованы генетичеcкие на-pушения методами пpеимплантационного гене-тичеcкого анализа (ПГА), являются ценными моделями для генетичеcкиx и фармакологиче-cкиx иccледований, оcобенно в теx cлучаяx, когда модели животные и клеточныx культуp отcутcтвуют или неадекватны. Мы пpедложили эту идею в 2004 г. [1,2], и в данной pаботе фокуcиpуем внимание на методаx, пpименяемыx для получения ЭCКч. По меpе pазвития заместительной клеточной теpапии, возpаcтает ин-теpеc к получению и поддеpжанию ЭCКч в уcловияx, cвободныx от pеагентов животного

Сокращения: ЭСКч - эмбриональные стволовые клетки человека, ПГА - преимплантационный генетический анализ, ПТ - полярные тела, ПЦР - полимеразная цепная реакция, ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка.

происхождения [3]. Мы предлагаем сравнительно простой и эффективный микрохирургический метод, который включает диссекцию тро-фэктодемы бластоцисты в присутствии интакт-ной блестящей оболочки, с использованием стеклянной пипетки и микроманипуляционных инструментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Процедура преимплантационного генетического анализа и генетическое диагностирование одиночных клеток. Эмбрионы, используемые для получения линий эмбриональных стволовых клеток человека с генетическими дефектами, были отобраны с помощью ПГА. Пациенты, послужившие донорами эмбрионов, дали письменное согласие в соответствии с требованиями, утвержденными Независимым советом по этике. Полярные тела (ПТ) и/или бластомеры извлекали из каждого эмбриона и анализировали методом полугнездовой мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или флуо-

50 мкм

Рис. 1. Первое полярное тело аспирировано в пипетку введенную через насечку блестящей оболочки при одновременном извлечении первого и второго полярных тел (а); бластомер аспирирован в пипетку, введенную через насечку блестящей оболочки (б).

ресцентной in situ гибридизации. Исследовали эмбрионы с выявленными генетическими дефектами. Доступ к эмбр иону обеспечивался частичным механическим рассечением блестящей оболочки приблизительно через 1 час после освобождения ооцитов от фолликуляр ного эпителия (кумулюса), через 39-42 ч после введения ХГЧ. Одиночный продольный разрез был произведен таким образом, что после извлечения пер во го полярного тела (ПТ1) можно было производить внутрицито плазматическую инъекцию спермы через отверстие в позиции 3-х часов напротив мейотического веретена. После оплодотворения и культивирования на протяжении 16-18 ч второе полярное тело (ПТ2) извлекали через то же самое отверстие. Если ПТ2 выделялось в стороне от изначального отверстия, производили второй, перпендикулярный разрез, обеспечивающий доступ к ПТ2. Для проведения анализа методом флуоресцентной in situ гибридизации биопсию первого и второго полярных тел можно осуществлять од-новр еменно (рис. 1а). Биопсию эмбриона производили на тр етий день эмбрионального развития путем создания клапанного отверстия со втор ым интерсекционным разр езом. Если к этому времени наблюдали раннюю компактизацию эмбриона, тогда для предотвращения межклеточной адгезии использовали среду без содер-

жания кальция и магния (Quinn's Advantage Medium with Hepes [Ca/Mg free]; Sage In-Vitro Fertilization, Inc, Trumbull, CT), обеспечивая возможность легкого извлечения бластомера без повреждения эмбриона (рис. 1б). При диагностике тр анслокаций была использована процедура ядерного переноса. Для этого один бластомер из каждого эмбриона был слит с мышиной зиготой и гетер окарионы культивировались до метафазной стадии, на которой они были зафиксированы и проанализированы методом флуоресцентной in situ гибридизации, с окрашиванием целой хромосомы [4]. Более детальное описание манипуляций с эмбрионами и описание диагностической процедуры см. в работе [5].

Получение и культивирование эмбриональных стволовых клеток человека. Внутриклеточную массу из бластоцист изолировали путем иммунохирургических методов с помощью антител к цельной сывор отке человека и комплемента морской свинки (Sigma-Aldrkh, США). Альтернативный микрохирургический метод выделения внутриклеточной массы со стоял в диссекции трофэктодермальных клеток с использованием стеклянных микропипеток (игл) и микроманипуляционных инструментов (рис. 2а). Клетки получали из внутриклеточной массы путем культивирования на инактивирован-

Рис. 2. Выделение внутриклеточной массы с использованием стеклянных микропипеток (игл) (а); пятидневный вырост, готовый к первому пассажу, сформировавшийся после посадки внутриклеточной массы (б).

ных митомицином эмбриональных Мишиных фибробластах (рис. 2б) в 4-луночных пластиковых чашках (Nunc, Napervile, США). Для клеточной культуры использовали среду К-DMEM (вЛсо 1пс.), обогащенную эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС, 15%) или ее заменителем Кпоскои1 Serum Иер1асешеп1 (SR-1), 2 мМ Р-меркаптоэтанолом и рекомбинант-ным фактором роста фибробластов человека в концентрации 5 нг/мл.

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Клетки отмывали фосфатным буфером, фиксировали 4%-м парафор мальдегидом на пр отяжении пяти минут. Для выявления экспрессии О с1>4 повышение проницаемости ядерной мембраны обеспечивали дополнительной обработкой холодным (—20°С) метанолом на пр отяжении пяти минут. После инкубации в течение 30 мин при 37°С с блокирующим раствором (10% ЭТС в фосфатном буфере) клетки инкубировали с первичными антителами (1:100) в течение 1 ч при 37°С. Иммуноокр ашивание пр оводили инкубированием в течение 1 ч при 37°С с использованием вторичных антител, конъюгированных с Р1ТС или TRITC (1:100). Подобным образом кроличьи поликлональные антитела к Ос11-4, крысиные моноклональные антитела SSEA-3, мышиные моноклональные антитела SSЕА-4, TR А-1-60 и TR А-1-81 использовали для анализа экспрессии этих маркерных белков. Все исполь-зованые антитела произведены компанией Сгаг Вю1есЬпо^у 1пс., СА, США. Для доокраши-вания ядер образцы помещали в среду, содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (Уе^ог Laboratories 1пск., Bur1ingame, СА, США), и просматривали на флуоресцентном микроскопе №коп (Япония). Для определения активности щелочной фосфатазы использовали тестовый набор компании Sigma (США) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека in vitro. Эмбриоид-ные тела были получены путем агрегации одиночных клеток во взвешеной капле. ЭСКч культивировали в суспензии в виде эмбриоидных тел на пр отяжении тр ех недель в среде DMEM с добавлением 15% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ Р-меркаптоэтанола. После этого эм-бриоидные тела замораживали, секционировали, помещали на предметное стекло и имму-ноокрашивали на маркеры трех эмбриональных слоев: S-100 использовали для определения диф-ференцировки в эктодерму, десмин использовали для определения дифференцировки в мезодерму и а-фетопротеин - для определения дифференцировки в эндодерму. Некоторые ли-

нии провер яли на их способность к диффер ен-цировке в двухмерной культур е.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе исследования были использованы 54 бластоцисты, отобранные после преимпланта-ционного генетического анализа. В тех случаях, когда изначальное число тестированных эмбрионов было известно, подсчитывали частоту развития до стадии бластоцисты, которая составила 52,8% (46/89). В основном линии ЭСКч были производными эмбрионов с генетическими заболеваниями, такими как адренолейкоди-стр офия, мышечная дистрофия Душена и Бек-кера, анемия Фанкони, синдром Мар тина-Белла (ломкой X-хромосомы), болезнь Хантингтона, синдр ом Мар фана, миотоническая дистр офия, тип I нейрофиброматоза, и талассемия. Некоторые линии являлись производными генетически нормальных эмбрионов, предварительно тестированных на анеуплоидию и пол или на гистосовместимость с р анее рожденным ребенком, которому для выживания была необходима тр ансплантация костного мозга. Эффективность получения линии ЭСКч со ставила 50% (27/54). В небольшом числе случаев, когда пол эмбриона был известен, появлялась возможность определить эффективность получения линий, в зависимости от половой принадлежности. Различие между женскими (71,4%; 5/7) и мужскими эмбрионами (60%; 3/5

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком