БИОФИЗИКА, 2011, том 56, вып. 5, с. 857-862
=МОЛЕКУЛЯР НАЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОФИЗИКА НАНОТЕХНОЛОГИИ in vivo
УДК 577.3
КЛЕТОЧНЫЕ ВОИНЫ C ПPИМЕНЕНИЕМ НАНОВООРУЖЕНИЯ
© 2011 г. Д.В. Яшин, Л.П. Сащенко, Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев
Институт биологии гена РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5 Поступила в p едакцию 09.06.11 г.
Рассмотрены некоторые механизмы противоопухолевого действия белка Tag7 и описаны три сценария проявления цитотоксических эффектов при образовании его комплексов с другими белками.
Ключевые слова: Т-лимфоциты, белок Tag7, белок теплового шока Hsp70, опухолевые клетки, цит от оксичност ь.
В организме животных и человека непрерывно идут клеточные войны. Особенно дра-матический характер они принимают при про -тивостоянии опухолевых клеток и защитных клеток о рганизма, относящихся в о сновном к Т-лимфоцитам и натуральным киллерам. В данной статье мы не пытаемся о хватить проблему целиком (число примеров слишком велико), а ограничимся лишь тремя примерами, описанными в наших исследованиях.
В рассматриваемых сценариях участвуют три белка, которые можно сравнить с нано-оружием. Это хорошо известный белок теплового шока Ы8р70 [1], белок Mts1/S100A4, играющий важную роль в метастазировании [2], и, наконец, открытый в нашей лаборатории белок Tag7/PGRP-S, которому принадлежит важная роль в противоопухолевой защите и врожденном иммунитете.
Ген, кодирующий Tag7, был открыт в нашей лаборатории в 1996 году [3]. Его название расшифровывается как tumor-assodated gen 7, потому что он был обнаружен при скринировании генов, избирательно экспрессирующихся в метастатических мышиных опухолях VMR-L относительно неметастазирующих VMR-O. Дальнейшие наши исследования показали, что функция Tag7 скорее направлена против опухолевых клеток. Кондиционная ср еда tag7-экcпpеccиpующиx клеток содержала Tag7 и обладала цитотоксической активностью против некоторых линий опухолевых клеток [4]. Поэтому мы исследовали противоопухолевую активность Tag7.
Как видно на рис. 1, трансфекция опухолевых клеток конструкцией, продуцирующей белок, резко подавляет их рост после перевивки изогенным животным. Скорость роста трансплантированных клеток падает по сравнению
c контрольными клетками, которые убивают мышь за один месяц. Опухоль же, со стоящая из модифицированных клеток, в конце концов рассасывается. Этот же эффект наблюдается и при трансплантации смеси контрольных и генетических модифицированных опухолевых клеток - в этом случае рассасывается около половины опухолей.
1-я и 2-я фазы клинических испытаний вакцины на основе трансфецированных аутологич-ных клеток меланомы и рака почек у пациентов с запущенными и устойчивыми ко всем видам лечения опухолями показали полную безвредность вакцин и положительный эффект, стабилизацию процесса или частичную, в 20-25%, регрессию опухоли [5]. Наблюдалась, в частности, регрессия метастазов (рис. 2).
Ввиду длительности и дороговизны пр оце-дуры с аутологичными клетками, мы перешли
■ VMR-0 ж VMR-0+VMR-0/tag7
• VMR-0/neo • VMR-0/tag7(l/2)
о VMR-0/tag7+AbtoTag7 • VMR/tag7
ММ':
Рис. 1. Генная терапия рака геном tag7. Рост опухоли в мышах из клеточных культур: культура клеток VMR-0; культура клеток VMR-0, трансфе-цированная пустой плазмидой; культура VMR-0, трансфецированная геном tag7 в присутствии антител к Tag7; смесь клеток VMR-0 и VMR-0, транс-фецированных геном tag7; клетки VMR-0, транс-фецированные геном tag7.
Рис. 2. Уменьшение метастаз меланомы в печени под действием вакцины с геном tag7: (а) - до лечения, (б) -после лечения.
Раковые клетки L929 и другие
Рис. 3. Схема секреции Tag7-Hsp70-комплекcа лимфоцитами.
на работу с аллогенными вакцинами, где использовали культуры генетически модифициро -ванных клеток от другого больного, которые содер жали максимальное число опухолевых антигенов, но не экспрессировали гена гистосов-местимости HLA. Начатые испытания дали результаты, сходные с полученными на аутоло-гичных вакцинах, но затем они были прекращены в связи с р езким повышением тр ебований к использованию клеточного материала. Между тем в опытах на животных некоторые из вакцин дали весьма обнадеживающие результаты.
Механизм противоопухолевого действия Tag7 предположительно может включать: привлечение антиген-презентирующих клеток, со -зревание дендритных клеток и, в итоге, обучение наивных Т-лимфоцитов и образование ци-тотоксических Т-лимфоцитов против клеток опухоли; привлечение натуральных киллеров (NK- и (1^КТ-клеток), что ведет к гибели опухолевых клеток, и прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки в комплексе с другими белками (см. ниже). В пользу первых двух предположений существуют некоторые
косвенные данные, требующие дальнейшего исследования. Т ретье предположение разработано более детально. И мы можем ра ссмотреть пример ы использования белка Та§7 и других белков в клеточных войнах.
Первый сценарий - активированный Т-лим-фоцит атакует опухолевые клетки с помощью Та§7-Ы8р70-комплекса.
Е сли взятые от здорового донор а лимфоциты инкубировать с антигеном в присутствии цитокина интерлейкина-2 (1Ь-2), то в них появляются СБ8+-цитотоксические лимфоциты, атакующие этот антиген [6]. Однако пр и инкубации лимфоцитов с 1Ь-2 без добавления антигена генерируется субпопуляция неспецифических СБ8+-лимфоцитов. В отсутствие антигена на поверхности СБ8+-лимфоцитов не возникает специфический Т-клеточный рецепто р и поэтому они могут узнавать и связываться с опухолевыми клетками, лишенными поверхностных антигенных молекул основного комплекса гистосовместимости (ЫЬЛ), являющихся ли-гандом для этого рецептора. В отличие от классических цитотоксических СБ8+-лимфоцитов, эти лимфоциты убивают опухолевые клетки не за счет секреции цитолитических гранул, со -держащих перфорин и гранзимы, а за счет Ра8Ь-Б а8-взаимодействия.
К роме того, эти лимфоциты могут реализовать дополнительный цитотоксический механизм [7]. В них образуется бинарный комплекс Та§7-Ы8р70, который при активации тем или иным способом секр етируется в среду и цито-токсичен для целого ряда опухолевых клеток (рис. 3). Мы пр оверяли это наблюдение, исследуя поведение белков Та§7 и Ы8р70 в ра створ е. Из данных на рис. 4 видно, что Та§7 может связываться с Ы8р70, образуя стабильный сте-
КЛЕТОЧНЫЕ ВОИНЫ C ПРИМЕНЕНИЕМ НАНОВООРУЖЕНИЯ
859
Рис. 4. Tag7 и Шр70 образуют цитотоксический комплекс. (а) - Гель фильтрация комплекса Tag7-Hsp70. (б) -Зависимость цитотоксичности Tag7-Hsp70-комплекcа от его концентрации. (в) - Цитотоксичность Tag7-Hsp70-комплекса. (г) - Цитотоксичность комплекса Tag7-Hsp70 в присутствии АТФ и его негидролизуемого аналога.
хиометрический комплекс. Максимальная цитотоксичность комплекса достигается уже при концентрации 10-10 М. Каждый белок, взятый отдельно, цитотоксичностью не обладает. Антитела к Tag7 или Hsp70 полностью подавляют цитотоксическую активность. Блокир ование АТФазной активности N-концевого домена Hsp70 с помощью негидролизуемого аналога АТФ (АМP-PNP) приводит к полному исчезновению цитотоксической активности. Следовательно, активной формой является комплекс Tag7-Hsp70-ADP [7]. Интересно, что CD8+-лимфоциты секретируют не только полноразмерный комплекс Tag7-Hsp70, но и продукты его расщепления с мол. массами 50, 30 и 17 кДа. Каждый из этих фрагментов также обладает цитотоксичностью. Так как Tag7-Hsp70-комплекс сек ретир уется через аппарат Гольджи, можно предположить, что именно там происходит процессинг полноразмерного комплекса. Наши предварительные исследования структуры этих фрагментов с помощью MALDI-ана-лиза показали, что даже минимальный компонент содержит пептиды из разных областей двух исходных белков. Следует подчеркнуть, что эти пептиды так прочно связаны в единый комплекс, что не р аспадаются даже при электрофорезе в денатурирующих условиях. Очень важный вопрос, требующий самого тщательного изучения, состоит в понимании, какие дополнительные связи задействованы в обеспече-
нии высокой стабильности комплекса, состоящего из различных пептидов.
Таков один из механизмов неспецифической атаки опухолевых клеток цитотоксическими Т -лимфоцитами. Возможно, он используется для убийства появляющихся в о рганизме единичных раковых клеток.
Второй сценарий - р аковая клетка защищается от Tag7-Hsp70 с помощью белка
Небольшой (10 кДа) белок Mtsl избирательно продуцируется метастатическими опухо -лями и в значительной мере определяет их метастатический потенциал. Раковые клетки с высоким метастатическим потенциалом абсо-лютно не чувствительны к действию Tag7-^р70-комплекса [8]. Такая устойчивость, по-видимому, связана со способностью этих клеток выделять Mtsl во внешнюю ср еду и разваливать Tag7-Hsp70-комплекc (рис. 5). Мы обнаружили, что белок Mtsl образует нецитотоксические комплексы как с Шр70, так и с Tag7. Добавление этого белка к уже преобразованному Tag7-Hsp70-комплекcу вызывает его диссоциацию [9].
На рис. 6 показано образование двойных комплексов между всеми исследуемыми компонентами. Интересно, что взаимодействие Tag7 с Mtsl специфично. Из двух исследуемых нами белков 8100Л1 и 8100Л4 (Mtsl), входящих в состав одного семейства С а2+-связывающих белков Б100, только Mtsl (Б100Л4) может взаимо-
Рис. 5. Схема защиты метастазирующей р аковой клетки от действия Tag7-Hsp70 комплекса.
Рис. 6. Mtsl связывается с Tag7 и Hsp70. (а) - Попарное взаимодействие белков Hsp70, Tag7, Mtsl на колонках с антителами. (б) - Tag7 специфически связывается с Mtsl, не связываясь с белком S100A1.
действовать с Tag7. Рис. 7 демонстрирует вытеснение Tag7 из комплекса при добавлении
Рис. 7. Mts1 разрушает цитотоксический Tag7-Шр70-комплекс. (а) - Избыток Mts1, добавленный к предобразованному Tag7-Hsp70-комплекcу, снижает его цитотоксичность. (б) - Mts1 вытесняет Tag7 из Tag7-Hsp70-комплекcа на колонке с антителами к Hsp70.
избытка М181, сопровождающегося падением цитотоксической активности. В присутствии ионов Са2+ это вытеснение идет значительно эффективнее.
Таким образом, одним из способов защиты опухолевой клетки против секретируемого Т-лимфоцитом цитотоксического комплекса Та§7-Н8р70 является
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.