ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 2, с. 188-193
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 581.143.6:575.22
КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ РЕДКОГО ВИДА Hedysarum theinum Krasnob. (Fabaceae) И ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ РЕГЕНЕРИРУЕМЫХ РАСТЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ ISSR-МАРКЕРОВ
© 2015 г. А. А. Эрст, Н. С. Звягина, Т. И. Новикова, О. В. Дорогина
Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090
e-mail: annaerst@yandex.ru
Поступила в редакцию 01.07.2014 г.
В настоящем исследовании разработан протокол размножения редкого лекарственного растения Hedysarum theinum Krasnob. (копеечник чайный) в культуре пазушных почек in vitro и проведена идентификация регенерантов с помощью ISSR-маркеров. Установлено, что оптимальной средой на этапе собственно размножения является среда Гамборга и Эвелега, дополненная 5 мкМ 6-бензил-аминопурина, на этапе укоренения — 1/2 минеральной основы среды Мурасиге и Скуга, содержащая 7 мкМ а-нафтилуксусной кислоты. Для молекулярно-генетического анализа материнских растений и регенерантов H. theinum были выбраны шесть ISSR-праймеров. Выявлено от четырех до десяти амплифицированных фрагментов, размер которых варьировал от 250 до 3000 пн. В результате проведенного исследования подтверждена генетическая стабильность полученных регенерантов на протяжении пяти пассажей и их идентичность материнскому растению.
DOI: 10.7868/S0016675815020071
Копеечник чайный (Hedysarum theinum Krasnob., сем. Fabaceae L.) —многолетнее травянистое лекарственное растение, редкий высокогорный альпийский вид, эндемик, имеющий центрально-азиатско-южносибирский ареал [1, 2]. Этот вид обладает уникальным составом вторичных метаболитов, что обусловливает широкий спектр лекарственного действия, включая противовоспалительное, бактерицидное, спазмолитическое, иммунопротекторное, антиоксидантное и др. [3— 5]. В результате практики массовых заготовок сырья копеечник чайный в наиболее доступных популяциях находится на грани исчезновения. Чрезвычайно медленный рост делает этот вид особенно уязвимым. Корни считаются зрелыми и пригодными к заготовке в 30 лет. Лекарственные свойства растений копеечника чайного, биологические особенности и ограниченность произрастания являются предпосылками для разработки эффективных способов его размножения, включая биотехнологические подходы, с целью воспроизводства, сохранения in vitro и in vivo в живых коллекциях и дальнейшей реинтродукции.
Известно, что культивирование растений на искусственных питательных средах может вызывать сомаклональную фенотипическую и геноти-пическую изменчивость, которая возникает из-за in vitro-индуцируемого стресса [6, 7]. Поэтому
ключевым аспектом при использовании технологий in vitro для размножения редких и исчезающих видов растений является проверка генетической идентичности получаемых регенерантов.
На сегодняшний день одним из наиболее точных и достоверных инструментов для выявления и изучения сомаклональной изменчивости являются молекулярно-генетические методы, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) при амплификации специфичных ДНК-маркеров, отличающих сомаклоны от исходного генотипа. Современные методы генетического анализа, такие как RAPD (Random Amplified Polymorphie DNA), ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats), широко используются для идентификации генотипов, паспортизации видов и сортов [8—18]. Мы использовали метод электрофореза межмикроса-теллитных участков геномной ДНК (ISSR-ана-лиз), так как известно, что этот метод является наиболее воспроизводимым, удобным, чувствительным и полиморфным среди анонимных методов фрагментного анализа [19—21].
Цель данного исследования — разработка методики размножения H. theinum в культуре пазушных почек in vitro и проведение генетической
идентификации материнского растения и полученных регенерантов с помощью ISSR-маркеров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Размножение in vitro
Исходные материнские растения H. theinum были отобраны с коллекционного участка "Редкие и исчезающие виды Сибири" (ЦСБС СО РАН). Данные растения были получены путем посева семян, взятых из природной популяции H. theinum (гора Красная, Республика Горный Алтай), и характеризуются высоким содержанием ксантонов и флавонолов [22].
Материалом для введения в культуру in vitro копеечника чайного послужили пазушные почки пяти взрослых генеративных растений. Их стерилизовали 0.1%-ным раствором сулемы (HgCl2) в течение 15 мин с последующим трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой. Среда для введения в культуру in vitro — Мурасиге и Скуга (МС) [23], дополненная 5 мкМ 6-бензил-аминопурином (БАП) и гидролизатом казеина (200 мг/л). Дальнейшее культивирование побегов копеечника чайного осуществляли на средах МС или В5 [24], дополненных 5 мкМ БАП. На этапе укоренения растений использовали 1/2 минеральной основы среды МС, содержащую 7 мкМ а-нафтилуксусной кислоты (НУК). Для культивирования эксплантов были подобраны следующие условия: фотопериод — 16/8 ч свет/темнота, освещенность — 2—3 клк, температура — 24 ± 1°С.
Растительный материал из культуры in vitro фиксировали после каждого из пяти пассажей. Для этого листья регенерантов заворачивали в фильтровальную бумагу и помещали в пластиковые зип-пакеты, наполненные силикагелем. Для идентификации материнского генотипа и изучения генетической изменчивости регенерантов первого—пятого поколений использовали ISSR-анализ.
Экстракция ДНК и ISSR-анализ
Экстракцию ДНК проводили с помощью Nu-cleoSpin Plant II kit (Macherey and Nagel, USA). Чистоту и концентрацию полученных экстрактов ДНК определяли спектрофотометрически (Eppendorf, Germany). Чистота ДНК была рассчитана как соотношение величин оптической силы экстракта при длине волн 260 и 280 нм.
В исследовании было использовано шесть ISSR-праймеров, предварительно отобранных для изучения изменчивости растений H. theinum, характеризующихся наиболее высоким полиморфизмом амплифицированных фрагментов и значительной репрезентативностью ISSR-паттерна [25]. Реакционная ПЦР-смесь объемом 25 мкл
содержала 2.7 мМ MgCl2, 1.25 мМ праймера, 0.4 мМ мононуклеотидов, 1х PCR-буфер, 1.5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Медиген, Россия) и 50 нг матрицы. Программа амплификации состояла из следующих этапов: денатурация ДНК — 1.30 мин при 94°C; 35 циклов амплификации — 0.40 мин при 94°C, 0.45 мин отжига праймера при 41—47°C и 1.30 мин при 72°C; заключительный этап пролонгирования нуклеотидной цепи — 5 мин при 72°C. ПЦР проводились в С 1000 Thermal Cycler (BioRad Laboratories, USA). Для каждого праймера была рассчитана температура отжига (Ттеор). Оптимальная температура отжига (T^^) подбиралась эмпирически. Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле в 1х TBE-буфере. Полученные ISSR-фрагменты были окрашены SYBR-Green (Медиген, Россия), визуализированы с помощью системы гель-документирования Gel Doc XR+ и проанализированы с использованием программного обеспечения Image Lab Software (Bio-Rad Laboratories, USA). Размер ISSR-фрагментов определяли с помощью молекулярного маркера массы 1 kb (Медиген, Россия). Каждый амплифи-цированный фрагмент рассматривался как доминантный маркер и для изучаемых образцов отмечалось его присутствие (1) либо отсутствие (0).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В Центральном сибирском ботаническом саду (ЦСБС СО РАН, г. Новосибирск) проводятся ре-интродукционные работы в популяциях H. theinum, произрастающих на горе Красной. При этом в качестве посадочного материала используются семена и сеянцы, выращенные из семян [26]. Для получения высококачественного посадочного материала целесообразно также использовать биотехнологические приемы.
Использованный режим поверхностной стерилизации пазушных почек H. theinum позволил получить 40% жизнеспособного неинфицирован-ного растительного материала. После введения в культуру на среде МС, дополненной 5 мкМ БАП, из пазушных почек развивались побеги с непар-носложными перистыми листьями, что соответствовало виргинильной фазе роста растений данного вида. При последующих пересадках происходила реювенилизация растений, и наблюдали только тройчатые листья (ювенильная фаза развития) (рис. 1,а, б).
Экспланты культивировали в течение пяти пассажей на средах одного и того же состава — В5, дополненная БАП 5 мкМ. В течение первых трех пассажей размножение осуществляли за счет деления побега на одноузловые сегменты (коэффициент размножения составил 2 шт./экспл.). На четвертом и пятом субкультивировании наблюдали развитие адвентивных почек у основания по-
190
ЭРСТ и др.
Рис. 1. Этапы клонального микроразмножения Hedysarum theinum в культуре пазушных почек in vitro. a — регенерант в виргинильной фазе роста (первый пассаж); б — регенерант в ювенильной фазе роста (третий пассаж); в — массовое заложение адвентивных почек (пятый пассаж). Масштаб: 1 см.
MMp 1 2 3 4 5 Mpl 2 3 45 Mpl 2 3 45 MMp 12345Mp 12345 Mp 12345
Рис. 2. Электрофореграмма 188К-фрагментов, полученных при амплификации ДНК материнского растения Нейу8-агит Метит и регенерантов, с праймерами: а - 17898А, б - 844А, в - НВ14, г - 844В, д - 17899А, е - 17898В. М -молекулярный маркер; Мр - материнское растение; 1-5 - регенеранты первого-пятого пассажей.
бега (коэффициент размножения составил 9.2 ± ±1.1 шт./экспл.), что может свидетельствовать о накоплении в тканях эксплантов регуляторов роста (рис. 1,в). Полученные микропобеги Н. Летит переносили на среды для укоренения. Ризогенез наблюдали через три недели культивирования.
В результате амплификации ДНК-матрицы регенерантов и материнского растения Н. Летит с разными 188Я-маркерами получено от четырех до десяти фрагментов, характеризующихся размерами от 250 до 3000 пн (рис. 2, таблица). Кроме того, все электрофоретические спектры 188Я-
Характеристики ISSR-праймеров, использованных в работе
Праймер Нуклеотидная последовательность, 5'—3' Температура отжига, °С Число амплифицированных фрагментов
Т А теор Т J оптим
17898A CACACACACACAAC 42 45 4
844A CTCTCTCTCTCTCTCTAC 54 44 6
HB14 CTCCTCCTCGC
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.