ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 229-234
УДК 581.1
КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА КУРЦИНА
© 2007 г. М.-Ц. Луо*, В.-С. Лиу**, С.-И. Янг*, И. Су*, Ф. Ян*, П. Хуан**, Ф. Чен*
* Колледж биологии, Сычуанъский университет, Ченду, Китай ** Чендусский институт планирования семъи, Ченду, Китай Поступила в редакцию 20.03.2006 г.
Белок курцин, выделенный из семян Jatropha curcas, можно использовать в качестве агента, обладающего цитотоксичностью. Для разработки методов выделения и изучения противоопухолевой активности рекомбинантного белка фрагмент ДНК, кодирующий зрелый белок курцина, вставляли в Esherichia coli штамма М15 и индуцировали экспрессию с помощью оптимального индуктора (0.5 мМ изопропил^^-тиогалактопиранозида). Рекомбинантный белок синтезировали в виде телец включения и выделяли методом аффинной хроматографии на колонке Ni-NTA. Данный белок инкубировали с опухолевыми клетками при разных концентрациях белка с различным временем инкубации. Обнаружили, что этот белок даже в очень низких концентрациях может ингибировать рост раковых клеток линий NCL-H446, SGC-7901 и S180.
Jatropha curcas - Esherichia coli - курцин - экспрессия - очистка - рекомбинантный белок - противоопухолевая активностъ
ВВЕДЕНИЕ
Белки, инактивирующие рибосомы (RIPs), содержащиеся во многих растениях, являются N-гли-козидазами. RIPs способны разрушать N-гликозид-ные связи между A4324 и полифосфатным остовом 28S рРНК в рибосомах печени крысы и таким образом прерывать трансляцию белка. RIPs являются предметом изучения в биологии и медицине из-за их уникальных цитотоксических свойств. Можно выделить три типа данных белков. RIPs типа I содержат одну цепь с ферментативной активностью, могут подавлять внеклеточный синтез белка, но являются относительно нетоксичными для клеток и животных. RIPs типа II и RIPs типа III значительно отличаются от RIPs типа I по лектиновой и ферментативной активности [1-4]. Курцин - это разновидность RIPs типа I. Он был впервые выделен Stripe [5] из семян Jatropha curcas и обладает свойством подавлять рост некоторых опухолевых клеток.
Сокращения: СДС-ПААГ - денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле, PBS - фосфатный буферный раствор, PMSF - фенилметилсульфонилфторид, RIP - белок, инактивирующий рибосомы, RT-PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, IPTG - изопропил-P-D-тиогалактопиранозид.
Адрес для корреспонденции: Dr. F. Chen. College of Life and Science, Sichuan University 24, South Section 1, Yihuan Road, Chengdu, Sichuan, 610041 China. Fax: +86-28-854172571; e-mail: chengfang@scu.edu.cn
Целью настоящего исследования являлось получение последовательности, кодирующей зрелый белок курцин, методом RT-PCR (полимераз-ной цепной реакции с обратной транскрипцией) и экспрессировать ее в Esherichia coli штамма M15. Мы также планировали разработать методику очистки и ренатурации рекомбинантного белка и оценить его противоопухолевую активность in vitro.
МЕТОДИКА
Материалы. Материалы получали от коммерческих поставщиков. Штаммы pQE30 и M15, колонку His-tag покупали у фирмы "Qiagen" (Германия). Наборы реактивов для RT-PCR и выделения ДНК покупали у фирмы "TaKaRa" (Япония). Набор реактивов лизатной системы ретикулоцитов кролика покупали у фирмы "Promega" (США). Семена Jatropha curcas собирали в г. Панжихуа провинции Сичуань (Китай). Праймеры синтезировали в Шанхайской биоинженерной компании. Штаммы, использованные в исследовании, обычно выращивали на среде LB. Остальные реактивы были химически чистыми.
Получение последовательности ДНК и конструкция рекомбинантного штамма. РНК экстрагировали из семян J. curcas методом Zhang Nianhui
[6]. Праймеры конструировали в соответствии с последовательностью курцина (Генбанк, № AY069946)
[7]. Для синтеза последовательности ДНК, кодирующей зрелый курцин, использовали метод RT-PCR.
Полученный фрагмент ДНК интегрировали в вектор pQE30 и экспрессировали в E. coli штамма M15, т.е. конструировали рекомбинантный штамм. Для дальнейших экспериментов отбирали единичную колонию E. coli рекомбинантного штамма M15 после дважды проведенного анализа последовательности ДНК путем энзиматического расщепления.
Оптимальные условия для индукции экспрессии ДНК в рекомбинантном штамме. С помощью денатурирующего электрофореза в полиакрила-мидном геле (СДС-ПААГ) определяли начало экспрессии ДНК для того, чтобы выяснить, продуцирует ли колония какой-либо рекомбинантный белок и где он находится. Отобранные колонии замораживали при -80°C в 20%-ном глицерине (вес/объем). Сконструированный штамм использовали для экспрессии последовательности ДНК, кодирующей данный белок, при различных условиях индукции. Мы сравнивали несколько индукторов (IPTG - изопропил^^-тиогалактопирано-зид, ксилозу и лактозу) в диапазоне концентраций 0.01-1.50 мМ. Индукцию синтеза рекомбинантного белка проводили в течение различных сроков (1-12 ч) при разной температуре, а также при варьировании времени добавления индуктора. Подбирали также оптимальную концентрацию ампициллина в диапазоне 50-400 мкг/мл.
Электрофорез в денатурирующих условиях (СДС-ПААГ) и вестерн-блот-анализ. Каждый образец для анализа методом электрофореза в по-лиакриламидном геле растворяли в 100 мкл биди-стиллированной воды, смешивали с 6 х СДС-бу-фером (0.35 M Трис-HCl, pH 6.8, 10.28% СДС, 36% глицерин, 5% ß-меркаптоэтанол, 0.12% бромфе-ноловый синий) и нагревали при 95°C в течение 8 мин. Образец центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин, 10 мкл супернатанта подвергали СДС-ПААГ электрофорезу с окрашиванием Ку-масси синим R-250. После его завершения проводили вестерн-блот-анализ [8] с использованием первичных антител RGS-His и вторичных антимышиных антител кролика, конъюгированных со щелочной фосфатазой.
Очистка и восстановление структуры рекомбинантного белка. Для увеличения экспрессии последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный белок, 1 л среды LB, содержавшей 25 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина, инокулировали 50 мл ночной культуры единичной колонии E. coli рекомбинантного штамма M15 и инкубировали на качалке при 250 об./мин и 28°C. Для индукции экспрессии pQE30-J1 в культуру с оптической плотностью 0.6-0.8, измеряемой при длине волны 600 нм, добавляли IPTG до конечной концентрации 0.5 мМ. Культуру инкубировали в течение 6 ч, а затем клетки осаждали
путем центрифугирования при 5000 g в течение 15 мин при 4°C. Собранную клеточную массу ре-суспендировали в 50 мл буфера А (50 мМ Трис-HCl, 0.5 ЭДТА, 50 мМ NaCl, pH 8.0), лизировали с помощью лизоцима в концентрации 150 мкг/мл и 100 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) и обрабатывали ультразвуком. Затем суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин при 4°C. Осадок ресуспендировали в 9 объемах буфера Б (буфер А с добавлением 0.5% Тритона X-100 и 10 мМ ЭДТА) и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин при 4°C, чтобы выделить тельца включения. Осадок, содержащий тельца включения, солюбилизировали буферами с разным рН (4-12), различными денатурирующими агентами (мочевина, гуанидинхлорид), смесью денатурирующего агента и соли. Суспензию хранили при 4°C в течение ночи и затем центрифугировали при максимальной скорости в течение 20 мин. После фильтрации через фильтр Mil-lipore (0.45 мкм) супернатант очищали с помощью Ni-NTA агарозной аффинной хроматографии в соответствии с методическими указаниями QIA ("Qiagen").
Активность выделенного рекомбинантного белка in vitro. В предшествующих экспериментах мы инкубировали природный и рекомбинантный белок с нормальными и опухолевыми клетками и обнаружили, что при определенных концентрациях белки не могут убить клетки. В данной работе мы определяли ингибиторную активность выделенного белка в бесклеточной трансляционной системе лизата ретикулоцитов кролика. Мы также инкубировали белок с такими опухолевыми клетками, как клеточный рак легкого (NCL-H446) и рак желудка (SGC-7901 и S180). Опухолевые клетки рестимулировали и инкубировали с очищенным белком при различных концентрациях. После 5 и 7 дней культуру клеток оценивали, используя проточный цитометр, спектрофотометр и флюороскоп. Концентрацию очищенного белка подбирали в соответствии с концентрацией природного белка, действующего на те же клетки. Ингибиторную активность рекомбинантного белка оценивали по результатам перечисленных тестов в соответствии с прежними работами [9, 10].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оптимальные условия синтеза рекомбинантного белка
Путем анализа последовательности ДНК в плазмиде pQE30-J1 методом двойного ферментативного расщепления мы показали, что фрагмент гена J1 правильно встраивался в вектор pQE30, что позволяло синтезироваться белку слияния в E. coli штамма M15. Исследование с помощью СДС-ПААГ электрофореза и вестерн-блот-ана-
(а) (б)
Рис. 1. СДС-ПААГ электрофорез и вестерн-блот-анализ рекомбинантного белка.
а - электрофоретическое исследование культурального осадка и очищенного рекомбинантного белка. Видно, что в культуральном осадке содержится много примесей, а после очистки осталось только две полосы. 1 - маркеры, 2 -культуральный осадок, 3 - очищенный белок; б - после дальнейшей очистки белка методом аффинной хроматографии на колонке №-№ГА в исследованной фракции осталась только одна полоса, что было подтверждено методом ве-стерн-блот-анализа. 1 - очищенный белок, 2 - маркеры.
лиза показало, что сконструированный штамм E. coli синтезировал интересующий нас белок в форме телец включения. Мы обнаружили, что среди всех индукторов, тестированных при различных концентрациях, оптимальным индуктором экспрессии гена, кодирующего данный белок, является IPTG в концентрации 0.5 мМ. Однако выход белка был очень низким. Мы обнаружили, что через 6 ч после добавления IPTG (при оптической плотности культуры 0.6 и концентрации ампициллина 100 мг/мл) наибольшее количество рекомбинантного белка удавалось получить при 28°C, а не при 37°C.
Очистка синтезированного белка
В нашем исследовании большая часть рекомбинантного белка была синтезирована в виде телец включения. Для фрагментации клеток с помощью лизоцима их
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.