ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2007, том 54, № 5, с. 755-762
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ МЕТАЛЛОТИОНЕИНОВ Arachis Нуро^аеа И ХАРАКТЕРИСТИКА АНМТ2А ГЕНА
© 2007 г. С. Ц. Цшань*' ***, Л. Шань**, Ю. П. Би**
* Шанъдунский нормальный университет, Цзинанъ, Шаньдун, Китай ** Шанъдунская сельскохозяйственная академия, Цзинанъ, Шаньдун, Китай *** Линъинский нормальный университет, Линъи, Шаньдун, Китай Поступила в редакцию 25.08.2006 г.
Выделено семь последовательностей кДНК, предположительно кодирующих металлотионеиновые белки арахиса (Arachis hypogaea L.), проанализированы соответствующие последовательности белков и подробно изучен один из белков - AhMT2a. Нозерн-гибридизация показала, что мРНК AhMT2a накапливалась в стеблях, молодых корнях и молодых листьях, и ее количество увеличивалось под воздействием кадмия, меди, АБК, H2O2 и теплового шока. Результаты изучения металло-связывающих свойств рекомбинантного белка, экспрессируемого Escherichia coli, показали, что бактерии, несущие ген AhMT2a, имели повышенную устойчивость к кадмию, меди и свинцу и в них накапливалось большее количество металлов, чем в контрольных образцах. В целом полученные результаты позволили предположить, что белок AhMT2a участвует как в детоксикации тяжелых металлов, так и в нейтрализации активных форм кислорода.
Arachis hypogaea - металлотионеин - тяжелый металл - активные формы кислорода
ВВЕДЕНИЕ
Металлотионеины (МТ) - низкомолекулярные (4-8 кД), богатые цистеином металлосвязы-вающие белки, обнаруживаемые у бактерий, грибов, а также у всех видов эукариотических растений и животных [1]. Различают четыре типа металлотионеинов растений в зависимости от числа и расположения цистеиновых остатков. На сегодняшний день металлотионеины растений выделены только из пшеницы [2] и арабидопсиса [3]. Это обусловлено, главным образом, тем, что полипептиды, богатые цистеином, нестабильны в присутствии кислорода. Поэтому структура и функции металлотионеинов растений до конца не ясны. В частности, не изучены механизмы согласованной работы различных металлотионеинов. Имеющаяся на сегодняшний день информация о возможных функциях металлотионеинов растений получена на основе измерений уровней их экспрессии, а аминокислотные последовательно-
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; MT - металлотионеин; ИПТГ - изопропил p-D-тиогалактопирано-зид; 3'-RACE - быстрая амплификация 3'-концов кДНК (от Rapid Amplification of cDNA 3'-Ends); RT-PCR - полимераз-ная цепная реакция с обратной транскрипцией (от Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction).) Адрес для корреспонденции: Y.P. Bi. High-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan, Shandong, 250100 China. Fax: +86-531-83-17-8156; e-mail: yupingbi@vip.sina.com
сти составлены на основе расшифрованных последовательностей ДНК. С другой стороны, высказывается много предположений о физиологической роли металлотионеинов растений, в том числе об их участии в детоксикации тяжелых металлов, гомеостазе металлов, запасании необходимых металлов, реакции растений на стресс, регуляции процессов развития, нейтрализации активных форм кислорода (АФК) [4]. Тем не менее, значение металлотионеинов растений до конца не изучено.
В последние годы проводилось много исследований по выяснению роли металлотионеинов растений в детоксикации тяжелых металлов. Ряд металлотионеинов растений экспрессировали в бактериальных системах с целью изучения их металлосвязывающих свойств и способности придавать организму устойчивость к металлам. И действительно, было обнаружено, что ряд металлотионеинов обладает некоторым противотокси-ческим действием по отношению к металлам [4-8]. Экспрессия металлотионеинов растений в штаммах дрожжей, дефицитных по МТ, восстанавливала их устойчивость к кадмию, меди и цинку [9-12]. Повышенная экспрессия металлотионеинов в растениях усиливала их устойчивость к воздействию некоторых металлов [11, 13-16]. Кроме того, в многочисленных экспериментах было показано, что металлотионеины растений могут нейтрализовать АФК [1, 17-20].
755
8*
Основной целью нашего исследования было клонирование генов металлотионеинов Arachis hypogaea и изучение их роли в устойчивости растений к стрессу. Мы клонировали кДНК, кодирующие три металлотионеина второго типа, методами RT-PCR и 3'-RACE. После этого создали библиотеку кДНК незрелых семян A. hypogaea, провели их сиквенирование и получили последовательности четырех кДНК, кодирующих метал-лотионеины типа 2, 3 и 4. Для изучения роли одного из этих генов, а именно, AhMT2a, мы провели но-зерн-блот анализ экспрессии рекомбинантного белка в Escherichia coli. Результаты показали, что белок AhMT2a может участвовать в детоксика-ции меди и кадмия, а также в нейтрализации АФК. Проведенное нами исследование поможет лучше понять роль металлотионеинов растений и работу кодирующих их генов.
МЕТОДИКА
Растительный материал и условия выращивания. Растения арахиса (Arachis hypogaea L., сорт Luhua 14) выращивали в горшках с промытым водой песком и поливали раствором Хогланда. Для того, чтобы вызвать стресс металлами, двухнедельные растения поливали раствором Хогланда с добавлением 300 мкМ CdCl2, 200 мкМ ZnSO4 или 500 мкМ CuSO4 в течение 0, 6, 12, 24 и 48 ч. Другие виды стресса создавали обработкой растворами 80 мкМ АБК, 30%-ного ПЭГ 6000, 200 мМ NaCl или 7 мМ H2O2 в течение 24 ч. Тепловой шок создавали путем выдерживания растений при 42°C в течение 6 ч. После обработки образцы растений собирали, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°C вплоть до последующего выделения РНК. Ткани проростков A. hypogaea, обработанных растворами 300 мкМ CdCl2, 200 мкМ ZnSO4 или 500 мкМ CuSO4 в течение 15 дней, собирали, тщательно промывали водой и сушили в печи при 80°C до постоянного веса, после чего определяли содержание меди, цинка и кадмия в каждом из образцов на атомном адсорбционном спектрометре Varian 880 (США).
Клонирование кДНК металлотионеинов A. hypogaea. При помощи методов RT-PCR (полиме-разная цепная реакция с обратной транскрипцией) и 3'-RACE (быстрая амплификация 3'-концов кДНК) клонировали три кДНК с полной открытой рамкой считывания, кодирующие металлоти-онеины типа 2: AhMT2a (DQ178616), AhMT2b (DQ178617) и AhMT2c (DQ178618). Суммарную РНК молодых корней проростков A. hypogaea обрабатывали обратной транскриптазой, и полученную кДНК использовали в качестве матрицы для PCR с двумя вырожденными олигонуклеотид-ными праймерами, синтезированными, исходя из известной консервативной части последовательности генов металлотионеинов второго типа бо-
бовых: 5'-GAAAATGTCT(T/G)GCTG(T/C)GGTG-3' (смысловой) и 5'-GCAGTT(A/T)G(A/C)TCCA-CA(C/T)TT(G/A)CA-3' (антисмысловой). После секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК обеих последовательностей сконструировали два ген-специфичных праймера: праймер 1: 5'-CATGAAGGCACAGTTTGA (внешний) и праймер 2: 5'-TCTGCTGAGAACGGTGGCTG (гнездовой). С данными праймерами и олиго-дТ провели 3'-RACE-PCR, и продукт реакции секвенировали. Затем амплифицировали кДНК генов металлотионеинов с полной открытой рамкой считывания и двумя вновь разработанными праймерами: 5'-GAAAATGTCTTGCTGTGGTGG (смысловой) и 5'-TTACACGACACAAGTCAAACC (антисмысловой), после чего расшифровали последовательности обеих цепей амплифицированных фрагментов. Четыре дополнительных клона полной цепи кДНК, кодирующей металлотионеины арахиса, были получены из библиотеки кДНК, созданной из семян, собранных на 20-60-й день после опыления методом частичного секвенирования произвольно выбранных клонов кДНК. Их последовательности были представлены в Генбанке (номера доступа для AhMT2d - DQ665256; AhMT3a -ABG57065; AhMT4a - DQ665258; AhMT4b -DQ665259).
Гибридизация РНК и ДНК. ДНК выделяли по методу Murray и Thompson [21], а суммарную РНК -по методу Chomczynski и Sacci [22] с некоторыми изменениями. Образцы ДНК и РНК переносили на нейлоновую мембрану N+-Hybond ("Amer-sham", Великобритания). Гибридизацию проводили по методу Ma с соавт. [23] с а-32Р-дЦТФ-меченым зондом кДНК AhMT2a.
Гетерологическая экспрессия AhMT2a в E. coli. На основе праймеров, использованных для амплификации кодирующей области гена AhMT2a, были синтезированы два праймера: 5'-GCcatatgTGTCTTGCTGTGG-3' (смысловой) и 5'-CTCgaattcAAACCATAGCCACT-3' (анти-смысловой) (строчными буквами обозначены сайты NdeI и EcoRI) для облегчения внутрирамочного связывания с pET28a(+) вектором ("Novagen", США). Наличие вектора в рекомбинантной плазмиде pET28a-AhMT2a проверяли секвенированием, после чего ее трансформировали в E. coli BL21. Для выделения рекомбинантного белка ночную культуру бактерий, содержавшую pET28a-AhMT2a, разводили в отношении 1 : 100 (по объему) в свежей среде LB, содержавшей 50 мкг/мл канамици-на. Вводили 1 мМ раствор изопропил ß-D-тиога-лактопиранозида (ИПТГ) в препарат бактерий с оптической плотностью 0.6 при 600 нм, после чего культуры растили в течение 3 ч на качалке при 37°C. Собранную культуру дважды промывали в 100 мл лизирующего буфера (50 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 8.0, содержавший 0.3 М NaCl и 10 мМ имидазол), ресуспендировали в 10 мл лизи-
рующего буфера, содержавшего протеазу и лизо-зим, инкубировали при 37°C в течение 30 мин, затем проводили обработку ультразвуком на аппарате UP200S тремя циклами по 1 мин при полной мощности и охлаждали в течение 2 мин на льду. Обработанную звуком суспензию клеток центрифугировали, а супернатант собирали для дальнейшей обработки. Белок с меченым гистидином выделяли, путем нанесения супернатанта на хелати-рующую хроматографическую колонку HP ("Amersham") в 1 мл Hi-Trap. Отобранные фракции разделяли методом ДДС-электрофореза в 15%-ном ПААГ и окрашивали серебром.
Для исследования устойчивости к металлам и накопления металлов в трансформированных и контрольных клетках E. coli вызывали экспрессию AhMT2a путем добавления 1 мМ ИПТГ в 1.5-литровые колбы с бактериями в среде выращивания. Начальная оптическая плотность препаратов составляла 1.0 при 600 нм. В среду добавляли растворы 300 мкМ Pb(NO3)2, 400 мкМ CdCl2 или 2000 мкМ CuSO4. Рост бактерий контрол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.