ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 73-84
УДК 581.1
КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ НОВОГО СЕМЕЙСТВА КОНСЕРВАТИВНЫХ МЕМБРАННЫХ ЦИНК-СОДЕРЖАЩИХ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗ ИЗ Solanum surattense
© 2007 г. С. Сун*' **, С. Лиу**, С. Го***, Б. Хуан**, В. Ли**, С. Ван**, Ц. Лин**, К. Тан*' **
* Колледж сельского хозяйства и биологии, Исследовательский центр биотехнологии растений, Шанхайский университет им. Цзяо Туна, Шанхай, Китай ** Государственная центральная лаборатория генной инженерии, Институт генетики, Колледж биологических наук, Фуданский университет, Шанхай, Китай *** Колледж биологических наук, Университет пров. Хэнань, Кайфын, Китай Поступила в редакцию 13.12.2005 г.
Пептидазы содержатся практически во всех организмах. Их гены составляют 1-5% генома. Благодаря достижениям генетики, биохимии и молекулярной биологии, в последние годы было идентифицировано и охарактеризовано несколько протеаз из органелл растений. Все они идентичны бактериальным протеазам, из которых лучше всего охарактеризованы протеазы Echerichia coli. Мы выделили и охарактеризовали три новых гена из Solanum surattensе, названных Sszn-mp1, Sszn-mp2 и Sszn-mp3. Для определения субклеточной локализации, структуры и функции этих трех генов использовали комплексный подход к исследованию генома: поиск данных, изучение профиля экспрессии, биоинформационное прогнозирование. Было обнаружено, что гены Sszn-mp конститутивно экспрессируются в тканях, и их экспрессия регулируется различными стимулами. Анализ восьми цинк-содержащих металлопротеаз (Zn-MP) Arabidopsis thaliana, томата, картофеля, хлопчатника, ячменя, сахарного тростника, риса и четырех цинк-содержащих металлопротеаз из цианобактерий (сине-зеленых водорослей) с помощью базы данных Генбанка выявил, что эти белки составляют новое семейство мембранных цинк-содержащих металлопротеаз. Zn-MP растений и SsZn-MP3 идентичны более, чем на 62%, в то время как АТФ-зависимые цинк-содержащие металлопротеазы из цианобактерий короче, чем Zn-MP растений более, чем на 110 аминокислотных остатков с N-конца, и имеют меньше гомологии с SsZn-MP3. В базах данных генов эукариот и прокариот не найдено последовательностей, гомологичных Zn-MP. Следовательно, Zn-MP - это семейство, специфичное для царств растений и цианобактерий. Гены Zn-MP растений кодируют мембранные белки хлоропла-стов и плазмалеммы, а гены Zn-MP бактерий кодируют белки цитоплазматических мембран, причем благодаря отщеплению N-концевых пептидов, происходит формирование зрелых мембранных белков субклеточных структур. Белки Zn-MP содержат консервативный участок связывания цинка (HEAGHX19E/DX46~48EX7E), участок, обладающий свойствами рецепторов, связывающихся с G-бел-ком семейства 1 (GPCP) и триплетную последовательность (N-R/K-F), характерную для Zn-MP растений, или D/E-R-Y, характерную для четырех бактериальных Zn-MP. Предполагается, что различные зрелые формы Zn-MP белков могут функционировать как протеазы и/или рецепторы сигналов.
Solanum surattense - биоинформатика - цианобактерия - G-белок-связанныйрецептор - пептида-за - цинк-содержащая металлопротеаза (Zn-MP)
ВВЕДЕНИЕ
Протеолиз необходим для поддержания многих клеточных функций, в том числе регуляции метаболизма, биогенеза органелл, клеточного
Сокращения: EST - маркерные экспрессирующиеся последовательности (от expressed sequence tag); GPI - гликозили-рованный фосфатидилинозит; GPCP - рецептор, связанный с G-белком; MP - мембранный белок; ПЦР - полимеразная цепная реакция; Zn-MP - цинк-содержащий MP. Адрес для корреспонденции: Kexuan Tang. School of Agriculture and Biology, Plant Biotechnology Research Center, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China. Fаx: 86-21-62824073; e-mail: kxtang1@yahoo.com, kxtang@sjtu.edu.cn
цикла, поддержания гомеостаза и апоптоза [1]. Пептидазы могут расщеплять как специфичные пептидные связи (выборочный протеолиз) в зависимости от аминокислотной последовательности белка, так и все пептидные связи пептида, разлагая его на аминокислоты (полный протеолиз) [2]. Результатом активности пептидаз могут быть деструктивные изменения белка с нарушением его функции, расщепление белка до главных функциональных компонентов, активация функции белка или сигнал на пути передачи сигнала [3]. Пептидазы группируются в семейства и кланы, при этом кланами называются группы семейств, для
которых имеются доказательства наличия общих предков.
Семейства классифицируются по типу катализатора и обозначаются начальной буквой названия катализатора: тип А (аспартат), тип С (цисте-ин), тип G (глутаминовая кислота), тип М (металл), тип Б (серин), тип Т (треонин), тип и (катализатор не известен). Клан, включающий семейства более чем одного типа, относится к типу Р [4, 5]. Сериновые, треониновые и цистеино-вые пептидазы используют каталитическую аминокислотную часть в качестве нуклеофила для формирования промежуточного ацильного соединения. Эти пептидазы могут также легко функционировать как трансферазы. Для аспара-гиновых, глутаминовых и металлопептидаз нук-леофилом является активированная молекула воды [4, 5].
Из шести каталитических типов протеаз ме-таллопротеиназы наиболее разнообразны по структуре и функциям [6]. Члены этого семейства расщепляют внутренние пептидные связи белков или олигопептидов и катализируют экстенсивно протекающие процессы, такие как расщепление или деградация потребляемых белков, а также построение тканей, поддержание их структуры и ремоделирование [7]. Они также участвуют в процессе выборочного протеолиза -высоко специфичном расщеплении только определенного типа пептидных связей с целью активации и дезактивации самих себя или других (про)ферментов, биоактивных пептидов или ре-прессоров ДНК. Таким образом, они принимают участие в механизмах регуляции. Это важно для контроля кровяного давления, гомеостаза гормонов, регуляции путей передачи сигнала [8], модуляции межбелковых и межклеточных взаимодействий и т.д. [9]. Большинство этих ферментов содержат цинк, называются цинкинами и содержат короткую последовательность НЕХХН, включающую два гистидина, выступающих в роли лиган-дов, взаимодействующих с катализатором цинком, и глутамат как общее основание [7, 10]. По природе и расположению третьего белкового ли-ганда цинка в трех структурно охарактеризованных кланах цинкины подразделяются на глуцин-кины (содержащие глутамат в составе третьего лиганда связывания с ионом металла), аспцинки-ны (содержащие аспартат) и метцинкины (содержащие гистидин или аспартат) [7]. Выделено более 50 семейств и 24 кланов металлопротеаз [6]. Геном Arabidopsis включает 81 ген металлопротеаз из 12 разных кланов. На сегодняшний день охарактеризованы только некоторые из этих ферментов, такие как лейциновая аминопептидаза и стромальная пептидаза [6].
В данной работе мы, используя комплексный подход к исследованию генома, а именно, поиск
данных, изучение профиля экспрессии и биоинформационное прогнозирование, изучали три новых неизвестных гена у вида S. surattense из сем. Бо1апасеае, имеющего большое медицинское значение, важного для выведения ценных форм баклажанов и несущего много полезных агрономических свойств, в частности широкий спектр устойчивости к различным заболеваниям. Анализ экспрессии генов показал, что ген Sszn-mp конститутивно экспрессируется в тканях, уровень его экспрессии различен и регулируется стрессовыми воздействиями окружающей среды. Гомологи SsZn-MP3 были обнаружены и выделены только из других растений и цианобактерий, и эти белки могут быть объединены в новое семейство консервативных белков. Биоинформационный анализ показал, что это кланом мембранных белков (МР), имеющих в своем составе консервативный домен цинк-содержащих металлопротеаз ^п-МР). Мы также рассмотрим субклеточную локализацию и функции семейства Zn-MP белков.
МЕТОДИКА
Растительный материал, условия выращива-Нил и предобработка. Семена Solanum surattense были любезно предоставлены проф. B.L. Zhou из Колледжа растениеводства при Шеньянском сельскохозяйственном университете (Китай). Семена S. surattense проращивали при 25°C с фотопериодом 14 ч свет/10 ч темнота. Семинедельные проростки S. surattense выращивали в маленьких пластиковых цветочных горшках и опрыскивали 50 мкМ АБК, 100 мкМ метилжасмоната, 0.5 мМ салициловой кислоты, 200 мкМ H2O2, 1 мМ CuCl2 или 250 мг/л ГК3. Одновременно ряд контрольных растений обрабатывали аналогичным образом дистиллированной водой. Для создания тем-новых условий проростки, накрытые черным пакетом, помещали в световой термостат с выключенным светом при 28°C, так что присутствовало минимальное количество остаточного света. Для воздействия холода проростки сначала выращивали при 28°C в течение 4 дней, затем -при 4°C в течение 16 ч и снова при 28°C в течение 32 ч.
Выделение РНК. После опрыскивания и выращивания в различных условиях листья семинедельных проростков S. surattense собирали в различные моменты времени, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до выделения РНК. Суммарную РНК из листьев выделяли при помощи набора реактивов Plant RNA Mini Kit ("Watson", Китай), согласно прилагаемой инструкции. Этим же методом выделяли РНК из различных органов, в том числе из старых желтых листьев, молодых листьев, корней, стеблей и семян. Качество и концентрацию РНК контроли-
ровали с помощью агарозного гель-электрофореза и спектрофотометрического анализа.
Клонирование полноразмерной кДНК. Библиотеки 3' и 5' кДНК создавали при помощи набора Clontech SmartTM RACE cDNA Amplification Kit ("Clontech", США), пользуясь мРНК, выделенной из листьев S. surattense. На основе расшифрованной последовательности BT014326 (код в базе данных Генбанка) для L. esculentum синтезировали два праймера: Sszn-mpF1 (5'-ATGGGGAGTAT-TGCTGCATATTGTGGTG-3') и Sszn-mpR1 (5'-CTA-CAAATCATCATCGCTGATGGATTTC-3'). Поли-меразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в объеме 50 мкл, содержащем 1 мкл библиотеки 3' кДНК в качестве матрицы. После начальной стадии денатурации в течение 3 мин при 94°C следовали 32 цикла амплификации (94°C в течение 1 мин, 58°C в течение 30 c, 72°C в течение 1 мин) с праймерами Zn-M
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.