ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 452, № 2, с. 217-220
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.212.3:577.112
КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ кДНК, КОДИРУЮЩЕЙ НОВУЮ КОРОТКУЮ ФОРМУ КИСЛОЙ ХИТИНАЗЫ КРЫСЫ
© 2013 г. Е. В. Ильницкая, В. В. Радченко, А. С. Родионова, А. М. Косырева, Т. М. Шуваева, член-корреспондент РАН В. М. Липкин
Поступило 18.04.2013 г.
БО1: 10.7868/80869565213270224
Известно, что в организме млекопитающих в патофизиологических условиях резко возрастает секреция кислой хитиназы (AMC^se, ChiA), представителя семейства хитиназных белков, накопление которых является отрицательным прогностическим маркёром многих воспалительных заболеваний самой различной этиологии [1]. Тем не менее вклад AMC^se в патофизиологию реакции воспаления еще до конца не изучен.
В данной статье впервые описано обнаружение увеличения синтеза двух форм AMC^se (длинной, размером 1564 п.о. и укороченной (short, sAMC^se), размером 1362 п.о.) на модели животных с воспалением, вызванным низкой дозой липополисахарида (ЛПС). Длинная форма идентифицирована ранее у грызунов и человека в условиях аллергического воспаления [2] (GenBank NM_207586). Для определения первичной структуры ранее неизвестной укороченной формы AMC-ase необходимо было установление полной последовательности ее кДНК. Здесь впервые представлена последовательность полноразмерной кДНК sAMC^se крысы (GenBank KC529649).
Из ткани респираторной выстилки модельных животных с острым эндотоксикозом (крысам вну-трибрюшинно вводили ЛПС в дозе 1.5 мг/кг [3]) выделена стабильная фракция суммарной РНК при помощи набора RNeasy Minikit ("Qiagen", США). Синтезированная при помощи набора MINT-Universal ("Евроген", Россия) суммарная двухцепочечная кДНК (дц-кДНК) послужила матрицей для получения полноразмерной кДНК sAMC^se. На основании нуклеотидной последо-
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук, Москва
вательности кДНК длинной формы АМС-азы крысы, полученных из базы данных ОепБапк (ММ_207586), были синтезированы праймеры 1 и 2 (табл. 1), ограничивающие ее кодирующую область. С помощью этой пары праймеров были ам-плифицированы два продукта длиной 1220 и 1422 п.о., соответствующие кДНК укороченной и длинной форм АМС-а8е (рис. 1, дорожка 2). Их вырезали из геля, элюировали и клонировали в век-
Рис. 1. Идентификация укороченной формы AMC-ase крысы (sAMC-ase). Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов кДНК (25 циклов; 1%-й агарозный гель), содержащих кодирующие области — дорожки 1, 2 (получены с помощью праймеров 1 и 2, табл. 1) и нетранслируемые области — дорожки 4, 5 (получены с помощью инвертированных праймеров 3 и 4, табл. 1). В качестве матрицы использовали суммарную кДНК из выстилок контрольных (дорожки 1, 4) или модельных (дорожки 2, 5) животных. 3 — маркёр молекулярных весов SM#1113, "Fermentas".
218 ИЛЬНИЦКАЯ и др.
Таблица 1. Используемые в работе специфические праймеры
№ Праймер Нуклеотидная последовательность
1 AMC_forv 5 ' -AAGCTCATTCTTGTCACAGGTC - 3 '
2 AMC_rev 5 '-TTAGTTTCATGGCCAGTTGC - 3 '
3 3' UTR-AMC_forv 5'-TTCTGGCACTGCATCAATGG-3'
4 5' UTR-AMC_rev 5 '-CAGGAGAGTTTTCAGTTTGC-3'
тор pGEM-T Анализ клонов на наличие вставки проводили при помощи ПЦР с использованием стандартных праймеров, комплементарных последовательности вектора pGEM-T Секвенирование последовательности вставок отобранных клонов проводили с помощью автоматического газофазного секвенатора (Applied Biosystems 470А, США). На основании полученных данных были установлены нуклеотидные последовательности фрагментов кДНК, кодирующие укороченную форму АМС-аse крысы ^АМС^е) и длинную форму, идентифицированную ранее (GenBank NM_207586).
Последовательности 5'- и З'-нетранслируемых областей (UTR) sАМС-аse были определены методом инвертированной ПЦР [4]. Для этих целей суммарная дц-кДНК из респираторной выстилки крысы замыкалась в кольцо с помощью T4 ДНК-лигазы и использовалась в качестве матрицы для ПЦР с помощью специфичных праймеров З и 4 (табл. 1), комплементарных участкам, входящим в концевые области кодирующей части кДНК. Продукты амплификации длиной 577 и З75 п.о., содержащие нетранслируемые области и участки кодирующей последовательности длинной и укороченной форм АМС-аse соответственно (рис. 1, дорожка 5), клонировали в вектор pGEM-T и
определяли структуру последней (рис. 2). В результате анализа последовательности фрагмента размером 577 п.о., а также кодирующей области sAMC^se была определена нуклеотидная последовательность зрелой мРНК укороченной формы AMC^se (рис. 3). Полученные данные были подтверждены методом быстрой амплификации концов кДНК - RACE (Mint RACE primer set, "Евро-ген", Россия) согласно рекомендациям производителя.
Последовательность полноразмерной кДНК sAMC^se включает 1362 п.о. Белок sAMC^se крысы содержит 365 аминокислотных остатков. Определенная нами последовательность была депонирована в международную базу данных GenBank (KC529649).
При сравнении структур длинной и укороченной форм AMC^se выяснено, что последняя (sAMC^se) образуется в результате альтернативного сплайсинга гена ChiA (рис. 4).
Таким образом, нами впервые определена последовательность полноразмерной кДНК белка sAMC^se, экспрессирующейся в респираторной выстилке крыс в условиях экспериментального эндотоксикоза.
Т TCTGGCАС Т G CAT CAAT GG
TA TTGTGAGCCGACGTCGCA TGACTCCAGGCCGCCA TGGCAGCGGGA 7 I\j AATCACATATCAGCAGCATT GTCAGGCAGGGT TAGT TT T TGATACCAGCT GTAAT T GCTG CA
actggccatgaaactaatgttcttcacgaaatttctgccttctcccttaatcctcaccaaa ggtagcttgcttccattt aaagt tat g caat aaaat t gatagc cagaaaaaaaaaaaaaaaa
aaaaaäaaaaaaaa[gtactctgcgttgataccactgctt1/|ggtatcaacgcagagtacgggg|
ggagtactgaagacaacat ggcсaagctcattcttgt сacaggt ctggttcttctgctgaat
CGGCCGCCTGCAGGTCGACCA TA TGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGA TGCA TAGCTTGAGTATTCTA TAGTGTC ACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTG
NMNNNNN 3
NNNNNNN 5
Рис. 2. Нуклеотидная последовательность продукта амплификации кДНК sAMC-ase на кольцевой матрице, содержащей 5'- и З'-нетранслируемые области. Условные обозначения: 1 — последовательности полилинкера вектора pGEM-T, 2 — последовательности праймеров 3'UTR-AMC_forv и 5'UTR-AMC_rev, 3 — участок известной последовательности, кодирующей С-концевой фрагмент зрелого белкаs AMC-ase крысы, большим шрифтом выделен стоп-кодон TGA, 4 — последовательности праймеров "CDS-1 adapter" и "PlugOligo-1 adapter" ("Евроген", Россия), использованных для синтеза суммарной дц-кДНК, 5 — 5'- и З'-нетранслируемые последовательности полноразмерной кДНК sAMC-ase. Указаны границы клонированного в вектор pGEM-T фрагмента размером 375 п.о. (\...\) и место сшивания концов дц-кДНК в ходе инвертированного лигирования (../..).
КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ кДНК
219
5'-САБТАСТСААСАСААСАТССССААССТСАТТСТТСТСАСАССТСТССТТСТТСТССТСАА ТСТТСАССТСССААСАССАААСТСААААСТСТССТСССААТТССАССТТССААСТТТССА
м
5Т5СМЯ(2ТР
АСТОСТССТТТ сг ССАССАТСеГТТССАСТТСТСАСААССОССаСАССТТТАТТАССТСА
КГЬЛОУСГБ
Ь Б I. Б Н Е У
ЙТ С АТ С АААТ ТСС Т 6С САС АСТ АТСССТТ Т САТССАС ТСЙАССТ ССАСТ СССААТАСССА
Я в Б Р Р (2 Б К Н
р т
К Е
ввТ Т С АСйТвССАбС С С ТС С Т С АСКЗАСААбСАТСТ С Т ТСАСТ ОТ С С Т СИТ СААСЗ(ЗААСТА
Е А
0
N
Ь М
СвТ ЭААСЗС ТТ Т ТСАб САССАСССТАТ ЮЙСАССААС АСЮС С САСАТ Т САТ ССТ ТАС Т ССТ
А V А А Э
N
А в
ССТвТАвСТОСТваСАТТТССААСАТССАС<ЗС ТССС Т АТЙАСАТСССТСААСТ ТТ С ТСАС
Ь Б
Н
м
Н в Э И Б в У
ТАС С ТББАТТ Т САТСС АССТСАТСАСАТАТБАССТССАТСССТССТС (ЗСАТСССТАСАСТ
N
N А
N
С СССАСААСАС ТССТСТТТАСАААСТ С ССТАСТСАСАСТСССАССААТСССТАССТСААТ
V Б
УМИУНКВЫв
РАЕК
БТ ССАТ ТАТ С Т САТСААТТАСТОТААС САТААТССАСССССАССТСАСААССТСАТ Т СТТ
Р Е У в Н Т У
ь з н р г
ССАТ т т ССАСАСТАТ СвАС АС АСС ТАСАТ С С ТААСС ААС ССТ ТС Т ЭАТАС Т ССААТ Т ООТ
N
Р А в
Я О
И
СССССТАССТСТССТАЙ.ТСССССТССТССССССТАТАССАСЭСАСССТСССТТСТеееСС
У Е
ЬИ-ЫСАТОБИБ
р о
ТАС ТАТ САСАТТТ бТАССТТТС ТСАСАААТ СБДСС С АСТ САССАС Т <5<ЙЗАТ СС СС СССАС
УАУКСЫЕИУСУБЫ
К 5
СААСТ Т СС С Т АТЭС С Т АСААСССЗСААТ САС Т СвЗТ Т ЭЭС ТАТ йАТ ААТАТ С ААЭАСС Т ТС
АОНЬКСНЫРвСАМ
Н А
АбТСТ САА<ЗСС ТСАСТ ОЗС Т ТААССАСААСААСТ Т Т ССТССТ<ЗС САТ САТ СТ СОЗССАТГ
Ь Б
Т в
ГСОООКРРЬ
САС С Т Т йАССАСТ Т САС ТвСаС Т СТТТСТвТ БАССАСССААААТГ С С С ТСТ вАС И? СТАСТ
N
А Ь
Б С Т А Р
Т Т СААТАААСССС Т Т С АТАТ АС ССАСА<ЗС АЭАТТ вС АСАС С ССС Т С АСГ ТАС С ТТ С Т САА
Р в
в в в в в в
в в в
ССАСТААСТАСТС С Т С САССААОТСССАСТ ССТ&ЗТ ССААССТС Т ввТв(ЗА(5вТТ СТСАА
Г С А в К А Б в Х>
Р V А Б
Я N
вес аст сзат т ст с т эс тсссааас сасат о г сс т с т ас с с т ст со С АЭАТ САСАЭАААТ
н
N
ООН
<2 А
СС Т Т Т С ТЭ С САСТ вСАТ СААТ СС5ААТ САС С Т АТС АСС АС САТ ТСТ С АСЗССАССОТ ТАСГТ РБТЗСЫССЫИР«
Т Т Т САТАССАССТ СТААТТ СС Т ССААСТССС СА7ЧЗАААС Т ААТСТ Т С ТТ САС СААА Т Т ТС ТСССТТСТ СС СТТААТССТСАССАААССТАССТТССТТССАТ ТТ АААСТ ТАТ ССААТААА аттсатаэссаоаааааааааааааааааааааааааааааа-з'
60 120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260 1320 1362
Рис. 3. Последовательность полноразмерной кДНК и выведенная аминокислотная последовательность белка 8АМС-а8е. 5'-нетранслируемая область (выделена серым цветом), старт-кодон ДТО (выделен курсивом и жирным шрифтом), кодирующая область, стоп-кодон ТОА (выделен курсивом и жирным шрифтом), З'-нетранслируемая область (выделена серым цветом) и участок полиаденилирования (подчеркнут пунктирной линией), Козак-последовательность (выделена рамкой).
Рис. 4. Схематическое изображение структур длинной (I) и укороченной (II) форм кДНК ЛМС-а8е. Нуклеотидная последовательность укороченной формы отличается отсутствием фрагмента 73—274 п.о., присутствующего в длинной форме. Серым фоном обозначены 5'- и З'-нетранслируемые области. Подчеркнуты части консенсусных последовательностей, обеспечивающих сплайсинг мРНК укороченной формы ЛМС-а8е крысы.
220
ИЛЬНИЦКАЯ и др.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и кл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.