БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, № 3, с. 425-428
^ ПИСЬМА
РЕДАКТОРУ
УДК 577.21
КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ ДАЛЬНЕКРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА КАТАНКА СОДЕРЖИТ СИЛЬНЫЙ ДОНОРНЫЙ САЙТ СПЛАЙСИНГА
© 2011 г. Н. Г. Гурская, Д. Б. Староверов, А. Ф. Фрадков, К. А. Лукьянов*
Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступило в редакцию 10.11.2010 г. Принято к печати 22.11.2010 г.
Компьютерный анализ последовательности, кодирующей красный флуоресцентный белок КаШзЬка, выявил сильный донорный сайт сплайсинга в 3'-концевой области. Для экспериментальной проверки функциональности этого сайта была создана генно-инженерная конструкция, кодирующая белок Ка-ШзЬка и зеленый флуоресцентный белок Та§ОБР2, разделенные фрагментом гена тафаззина. Сплайсинг такой пре-мРНК должен приводить к сбою рамки между белками КаШзЬка и Та§ОБР2 при нормальном сплайсинге последовательности тафаззина либо к появлению слитого белка КаШзЬка-Та§ОРР2 в случае использования донорного сайта сплайсинга внутри последовательности katushka. Проточная цитофлу-ориметрия показала, что при экспрессии данной конструкции в клетках млекопитающих яркая флуоресценция наблюдается как в красном, так и в зеленом каналах детекции. Следовательно, сайт сплайсинга внутри гена katushka действительно является функциональным. Уничтожение данного сайта сплайсинга с помощью направленного мутагенеза без изменения аминокислотной последовательности белка КаШзЬка привело к исчезновению зеленого сигнала, что соответствует нормальному сплайсингу последовательности тафаззина. Полученный мутантный вариант кодирующей последовательности белка КаШзЪка может быть использован для анализа сплайсинга пре-мРНК на уровне отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии.
Ключевые слова: красный флуоресцентный белок, мутагенез, сплайсинг, флуоресцентное мечение.
Транскрипция генов эукариот приводит к появлению молекул пре-мРНК, состоящих из экзо-нов (кодирующих последовательностей) и интро-нов (некодирующих последовательностей). Затем происходит сплайсинг, в результате которого последовательности интронов удаляются, а экзоны остаются в составе молекул зрелых мРНК [1].
Классические методы анализа сплайсинга основаны на выделении РНК из клеток и анализе целевых транскриптов либо Нозерн-блот-гибриди-зацией, либо ОТ-ПЦР [2]. Главным недостатком такого подхода является отсутствие информации о прохождении сплайсинга в отдельных клетках. Возможность визуализации результатов сплайсинга дают подходы с использованием гибридизации РНК in situ. В свою очередь, данная технология не позволяет работать с живыми системами.
В последние годы все большую популярность приобретают методы анализа сплайсинга (включая альтернативный сплайсинг) с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) и других
Сокращения: GFP — green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок); TAZ — тафаззин. #Автор для связи (тел.: (499) 742-81-22; эл. почта: kluk@ibch.ru).
флуоресцентных белков [3—7]. Для этого создают рекомбинантные конструкции, включающие ген флуоресцентного белка и изучаемые экзоны и ин-троны, так, чтобы сплайсинг (или его отсутствие) приводил к появлению или исчезновению флуоресцентного сигнала ОБР. Это дает возможность судить о прохождении сплайсинга с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цито-флуориметрии на уровне отдельных живых клеток.
Недавно был описан яркий дальнекрасный флуоресцентный белок, названный КашЪка. Этот белок имеет максимум возбуждения при 588 нм и максимум эмиссии при 635 нм, молярный коэффициент поглощения составляет 65000 М-1 см-1, квантовый выход флуоресценции — 0.34 [8]. Высокая яркость флуоресценции в дальнекрасной области спектра в сочетании с высокой фотостабильностью и низкой токсичностью открывает широкие перспективы использования этого белка в экспериментальной биологии для т уыв-ими-джинга [9—11].
В настоящей работе мы проверили возможность применения белка Ка^зИка для анализа сплайсинга. Анализ кодирующей последовательности katushka с использованием сервера МеЮепе2
(а)
Экзон Интрон СТОТООССАОлОТАСТОСОАС V А R У С D
и6 и7 Д—□-
Артефактный сплайсинг
к&ткка э6 э7
ТА^
э8
Нормальный сплайсинг
к
о
ето 68
о
с е
^
и
л
о Ко
Пре-мРНК
ил
мРНК
Щ
Белок
91 г
Красный + зеленый (б)
53%, средн. 1415
I-1
45 -
22
10
87 г
к
§ 65
о
В 43 с е
¡^
и
оли21
К
10
101 102 103 Интенсивность флуоресценции К^шЬка, отн. ед.
104
324
к
§ 243
В 152 с е
и
Й 81
101 102 103 104 Интенсивность флуоресценции Та§ОБР2, отн. ед.
44%, средн. 685
10
154
к
о
ё 115
77
38
стоп
Красный (в)
1%, средн. 250
Ы,
I. ■.
ЦкЛ,.,
101 102 103 104 Интенсивность флуоресценции Та§ОБР2, отн. ед.
32%, средн. 900
НШ 1
1Ш|||Ы| Щ
10
101 102 103 Интенсивность флуоресценции Ка1шЬка, отн. ед.
104
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) выявил сильный донорный сайт сплайсинга (предсказанная вероятность 0.94), располагающийся в 3'-кон-цевой части кодирующей области. Сплайсинг должен проходить по триплету аргинина 224 вблизи С-конца белка. Очевидно, в отсутствие соответству-
ющего акцепторного сайта сплайсинг мРНК каШзк-ка не происходит, поэтому данный донорный сайт сплайсинга не мешает использованию этого флуоресцентного белка для большинства задач, таких, как мечение целевых белков, клеточных органелл и специфических популяций клеток. Однако он мо-
стоп
0
0
0
0
КОДИРУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ ... БЕЛКА KATUSHKA
427
Генетическая конструкция katushka-TAZ-taggfp2, использованная в работе, и результаты ее сплайсинга. Схема конструкции (а), кодирующей флуоресцентные белки Ка1;шИка (светло-серый прямоугольник) и TagGFP2 (темно-серый прямоугольник) с фрагментом гена 7AZмежду ними. Ген 7AZпредставлен экзоном 7 (э7), окруженном интронами 6 и 7 (и6, и7) и прилегающими короткими фрагментами экзонов 6 и 8 (э6, э8). Сверху показана нуклеотидная последовательность (и соответствующие ей аминокислотные остатки белка Ка1;шИка), потенциально способная выступать в роли донор-ного сайта сплайсинга. Левая часть схемы показывает результаты артефактного сплайсинга с вырезанием интрона 7 и интрона 6 с прилегающим участком кодирующей области (З'-концевой фрагмент гена katushka и экзон 6). Соответствующий продукт трансляции содержит немного укороченный красный флуоресцентный белок Ка1;шИка, слитый с зеленым флуоресцентным белком TagGFP2. Правая часть схемы показывает результаты нормального сплайсинга с вырезанием интрона 7 и интрона 6. Образующийся транскрипт кодирует флуоресцентные белки Ка1;шИка и TagGFP2 в разных рамках считывания, что приводит к синтезу только красного флуоресцентного белка. Цитофлуориметрия клеток НЕК293Т, временно трансфицированных конструкцией katushka-TAZ-taggfp2 (б) или аналогичной конструкцией с мутированным донорным сайтом сплайсинга в кодирующей области katushka (в). Возбуждение лазером 488 нм, детекция при 505—545 нм (верхние гистограммы) и 655—695 нм (нижние гистограммы).
жет представлять серьезную проблему при наличии дополнительных интронов в конструкциях, содержащих ген katushka.
Для экспериментальной проверки функциональности донорного сайта сплайсинга внутри кодирующей последовательности katushka мы создали следующую генно-инженерную конструкцию для экспрессии в клетках млекопитающих под контролем раннего промотора цитомегало-вируса (рисунок, а). Кодирующая последовательность katushka располагалась на 5'-конце химерного гена, далее следовал фрагмент гена тафаззи-на (TAZ), включающий конец экзона 6, интрон 6, экзон 7, интрон 7 и начало экзона 8 (мы взяли два интрона, а не один, поскольку данная конструкция будет использована нами в дальнейшем для изучения редких случаев альтернативного сплайсинга экзона 7), далее располагалась кодирующая последовательность зеленого флуоресцентного белка TagGFP2. Взаимное расположение кодирующих рамок было подобрано таким образом, чтобы нормальный сплайсинг (с участием донорного сайта между экзоном 6 и интроном 6) приводил к получению транскрипта со стоп-кодоном внутри экзона 7 (рисунок, а, справа), а артефактный сплайсинг (с участием донорного сайта последовательности katushka) — к транскрипту, где флуоресцентные белки Katushka и TagGFP2 кодируются в одной рамке считывания и не разделены стоп-ко-доном (рисунок, а, слева). Таким образом, появляется возможность различить пути прохождения сплайсинга по флуоресцентному сигналу: отсутствие зеленой флуоресценции TagGFP2 ожидается при нормальном сплайсинге, а присутствие — при артефактном сплайсинге. При этом предполагается, что оба варианта сплайсинга будут, вероятно, приводить к функциональному белку Katushka, поскольку изменения затрагивают только последние несколько аминокислотных остатков этого белка, расположенных вне основного структурного элемента ß-бочонка.
Культура клеток человека HEK293T была временно трансфицирована конструкцией, описанной выше, с помощью реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) согласно рекомендациям произ-
водителя. Клетки инкубировали в атмосфере СО2 при температуре 37°С в течение 48 ч. Далее проводили анализ клеток с помощью проточного цито-флуориметра Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США). Данный анализ показал, что клетки обладают яркой флуоресценцией как в красном, так и в зеленом каналах детекции (рисунок, б). Следовательно, сайт сплайсинга в конце гена katushka действительно является функциональным и участвует в сплайсинге в случае присутствия поблизости акцепторного сайта.
Для уничтожения донорного сайта сплайсинга в гене katushka мы провели направленный мутагенез с заменой триплетов GCC-AGG, кодирующих остатки Ala223 и Arg224, на триплеты GCT-CGC. Данные замены нарушали последовательность сайта сплайсинга (сервер NetGene2 не опознавал такую последовательность как потенциальный сайт сплайсинга), но не приводили к изменению аминокислотной последовательности белка Katushka. Для доказательства отсутствия сплайсинга по мутированному гену katushka был проведен анализ трансфицированных кле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.