научная статья по теме КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК, ОБЛУЧЕННЫХ В ПРИСУТСТВИИ ЦИСТЕАМИНА Биология

Текст научной статьи на тему «КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК, ОБЛУЧЕННЫХ В ПРИСУТСТВИИ ЦИСТЕАМИНА»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2012, том 52, № 1, с. 71-76

МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ =

УДК [57+61]::539.1.04:582.282.232

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК, ОБЛУЧЕННЫХ В ПРИСУТСТВИИ

ЦИСТЕАМИНА © 2012 г. А. В. Солодкова, Н. М. Кабакова, В. Г. Петин*

ФГБУ Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, Обнинск

Изучение динамики пострадиационного восстановления диплоидных дрожжевых клеток показало, что доля необратимых радиационных повреждений была одинаковой после облучения клеток в присутствии и отсутствие цистеамина. На этом основании делается вывод, что радиопротектор в равной степени снижает число первичных как восстанавливаемых, так и необратимых повреждений, индуцируемых ионизирующим излучением. Применение к полученным результатам математической модели, описывающей процесс пострадиационного восстановления, позволило сделать вывод, что вероятность восстановления клеток от радиационных повреждений в единицу времени под влиянием радиопротектора не изменяется.

Ионизирующее излучение, дрожжевые клетки, пострадиационное восстановление, цистеамин.

Существует мнение, что повышение радиочувствительности различными химическими и физическими факторами обусловлено подавлением процессов пострадиационного восстановления [1—3]. Многие авторы изучали процесс пострадиационного восстановления ДНК, а также культивируемых клеток млекопитающих нормального и опухолевого происхождения, подвергавшихся действию ионизирующего излучения в комбинации с гипертермией и различными химическими сенсибилизаторами, ингибирующими процесс пострадиационного восстановления [4—11].

Ингибирование восстановления могло происходить как за счет нарушения процессов восстановления (уменьшение константы или вероятности восстановления), так и за счет формирования большей доли необратимых повреждений, от которых клетки не могли восстанавливаться. Однако авторы процитированных работ сами эти параметры не оценивали.

По опубликованным в этих работах результатам было показано, что при действии ионизирующего излучения в комбинации с гипертермией [12, 13] или химическими ингибиторами восстановления [14, 15] радиочувствительность клеток повышалась благодаря увеличению доли клеток, неспособных к восстановлению (необратимый компонент), а не в связи с нарушением самого процесса восстановления (константы восстановления, характеризующей вероятность восстановления от радиационных повреждений в единицу

* Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4, МРНЦ РАМН; тел.: (48439) 970-08; факс: (495) 956-14-40; e-mail: vgpetin@yahoo.com.

времени). Аналогичный вывод получен и для дрожжевых клеток, подвергавшихся одновременному или последовательному действию гипертермии и ионизирующего излучения [16]. В этой работе показано, что вероятность восстановления в единицу времени остается постоянной (около 0.07 ч-1) и не зависит от продолжительности предварительного нагрева или от температуры, при которой происходило облучение клеток. Это означает, что около 7% оставшихся репарируемых радиационных повреждений восстанавливаются каждый час независимо от условий воздействия гипертермией и ионизирующим излучением. Сделан вывод, что с увеличением термической нагрузки скорость восстановления уменьшается, но не из-за нарушения самого процесса восстановления, а из-за увеличения доли необратимых повреждений, от которых клетки неспособны восстанавливаться.

На диких и мутантных штаммах бактериальных и дрожжевых клеток была продемонстрирована зависимость эффективности действия аминотиолов [17-19] и гипоксии [20-22] от способности клеток восстанавливаться после радиационных повреждений. В этих работах продемонстрировано, что радиорезистентность клеток, способных к восстановлению, повышалась при использовании ами-нотиолов и гипоксии в большей степени, чем для мутантов с пониженной способностью восстанавливаться от радиационных повреждений. Анализ кинетических схем реализации кислородного эффекта [23, 24] позволил авторам прийти к заключению, что защита с помощью аминотиолов и гипоксии осуществляется на стадии формирования первичных повреждений ДНК, а реализуется

окончательно на биохимической стадии формирования радиационного повреждения с помощью репарационной системы. Однако влияние радиопротекторов на вероятность восстановления и величину необратимого компонента изучено не было. Поэтому цель данной работы — сравнительная оценка параметров восстановления дрожжевых клеток, облученных в присутствии и отсутствие цистеамина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования были использованы дрожжевые клетки Баеекаготусез сеге-у1$1ае двух штаммов: диплоидный штамм Х8800 и гаплоидный штамм 8288С. В качестве протектора применяли цистеамин в концентрации 0.01 моль/л. В эксперименте использовали у-излучение радионуклида 60Со (установка "Исследователь"). Мощность дозы составляла 28.8 Гр/мин. Клетки в стационарной стадии роста помещали в раствор цистеамина за 30 мин до облучения. Облучение проводили в присутствии радиопротектора. Пострадиационное восстановление дрожжевых клеток происходило при выдерживании облученных клеток в непитательной среде в течение 3 сут при температуре 30°С. Восстановление происходило без присутствия цистеамина, так как при выдерживании клеток в 0.01 моль/л растворе цистеамина в течение 3 сут отмечалась гибель клеток в контроле. Клетки отмывали от препарата путем двукратного центрифугирования облученных суспензий в течение 10 мин при скорости 1000 об/мин. Выживаемость клеток оценивали по их способности образовывать видимые невооруженным глазом колонии, сформированные выжившими клетками после 5-суточной инкубации их на твердой питательной среде при 30°С. Экспериментальные серии повторяли 3—5 раз. Статистическую обработку получаемых данных осуществляли общепринятым способом. Достоверность оценивали по и критерию Стьюдента.

Для описания кинетики пострадиационного восстановления клеток использовали следующее уравнение [25, 26]:

DЭф(t) = Dl[K + (1 - Юе^],

(1)

где DЭф(t) — эффективная доза, соответствующая выживаемости клеток, достигаемой после восстановления в течение времени V, D1 — первоначальная доза, в которой были облучены клетки; K — необратимый компонент лучевого поражения, характеризующий долю невосстановленных повреждений; е — основание натуральных логарифмов; р — константа восстановления.

Этот параметр характеризует вероятность восстановления клеток от радиационных повреждений в единицу времени. Например, пусть р = 0.1 ч—1. Это

означает, что 10% от числа имеющихся репарируе-мых повреждений восстанавливается каждый час. Допустим, что начальное число репарируемых повреждений составляет 1000, тогда после восстановления в течение одного часа их останется 900, через 2 ч — 810, через 3 ч — 729 и т.д. Эти цифры показывают, что вероятность восстановления постоянна, а количество репарируемых повреждений уменьшается. Эта ситуация очень напоминает константу радиоактивного распада, когда доля распадающихся атомных ядер остается постоянной, а число распадов уменьшается.

Из уравнения (1) следует, что

в = - 1п {[Бэф(Г) - Дэф(«)]/[ А - Аф(«)]}/(2)

где DЭф(да) — эффективная доза, соответствующая плато кривой восстановления. Необратимый компонент лучевого поражения определятся выражением

K = Dзф(ю)/Dl. (3)

Описанная математическая модель пострадиационного восстановления будет использована в данной работе для количественной оценки параметров восстановления дрожжевых клеток, облученных в присутствии и отсутствие цистеамина.

РЕЗУЛЬТАТЫ

На рис. 1 представлены кривые зависимости выживаемости диплоидных дрожжевых клеток, штамм Х8800, от дозы облучения (рис. 1, А) и от продолжительности восстановления (рис. 1, Б). Клетки были облучены без радиопротектора (кривые 1, 3) и в его присутствии (кривые 2, 4). Кривые 3 и 4 показывают выживаемость клеток после 3-суточного восстановления их в непитательной среде. Стрелками на рис. 1 показан пример определения DЭф(да), DЭф(t) и D1. Эффективность действия радиопротекторов количественно оценивали фактором изменения дозы (ФИД), определяемым отношением изоэффективных (или среднелетальных) доз на кривых выживаемости, полученных с протектором и без него. В наших экспериментах ФИД = 1.510 ± 0.029.

Представляло интерес изучить влияние цисте-амина на выживаемость гаплоидных дрожжевых клеток. Как показано на рис. 2, А, гаплоидные дрожжи не восстанавливаются при выдерживании их в непитательной среде, их восстановление проявляется только на уровне резистентного "хвоста", который в наших экспериментах начинался с дозы в 400 Гр. Этот эффект проявляется из-за присутствия почкующихся гаплоидных клеток, размер которых составляет 1/3—1/2 размера материнской клетки. В этом случае в материнской клетке содержится двойной набор хромосом, поэтому радиобиологические реакции таких

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ

73

Продолжительность восстановления, ч 0 10 20 30 40 50

100

я 100

0.001

0.01

0.001

500 1000 1500 2000 2500 Доза, Гр

Рис. 1. А — Выживаемость диплоидных дрожжевых клеток БассНаготусез сегеугзгае, штамм Х8800, облученных у-кван-тами в присутствии (2, 4) и отсутствие (1, 3) цистеамина. Клетки высевали на питательную среду сразу после облучения (1, 2) и после 3-суточного восстановления в непитательной среде (3, 4).

Б — кривые зависимости выживаемости от продолжительности восстановления дрожжевых клеток после воздействия у-излучения в присутствии цистеамина (2) и без него (1).

0 200

Доза, Гр 400 600

800 1000

100

100

ь,

т с о

£

е а в

л

В

200 400 600 800 1000 Доза, Гр

0

Рис. 2. А — Выживаемость гаплоидных дрожжевых клеток БассНаготусез сегеУ131ае, штамм 8288С при высеве клеток на питательную сразу после воздействия у-излучения (1) и после 3-суточного восстановления в непитательной среде (2). Б — Выживаемость гаплоидных дрожжевых клеток, штамм 8288С, после воздействия у-излучения в присутствии (4) и отсутствие цистеамина (3).

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

0 5 10 15 20 25 30 Продолжительность восстановления, ч

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком