БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 150 - 156
УДК 577.354
КОЛОКАЛИЗАЦИЯ АДЕНОЗИНОВОГО РЕЦЕПТОРА A2B И АДЕНОЗИНДЕЗАМИНАЗЫ В МЕМБРАНАХ ПРИСТЕНОЧНЫХ КЛЕТОК СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА*
© 2015 Р.М. Арин**, А.И. Валледжо, Ю. Руеда, О. Фреснедо, Б. Очоа
Department of Physiology, Faculty of Medicine and Dentistry, University of the Basque Country UPV/EHU, Sarriena s/n, 48940 Leioa, Spain; fax: +34(946)015-662, E-mail: rosamaria.arin@ehu.es
Поступила в редакцию 24.07.14 После доработки 19.09.14
Аденозиновый рецептор A2B (A2BR) опосредует биологические ответы на внеклеточный аденозин в самых разнообразных типах клеток. Аденозиндезаминаза (ADA) — фермент, разрушающий аденозин и способный связываться с аденозиновым рецептором на внешней поверхности клеток. Аденозин регулирует секрецию ионов хлора пристеночными клетками слизистой оболочки желудка. Тесные функциональные связи между A2BR и ADA были обнаружены в клетках иммунной системы, но пока неизвестно, происходят ли взаимодействия этих двух белков в клетках желудочно-кишечного тракта. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы выяснить, коэкспрессируются ли A2BR и ADA на поверхности плазматических мембран секретирующих кислоту пристеночных клеток слизистой оболочки желудка. Клетки слизистой оболочки были изолированы после очистки элютриационным центрифугированием, а мембранная фракция была получена центрифугированием в градиенте сахарозы. Экспрессию мРНК A2BR анализировали методом ОТ-ПЦР. Поверхностную экспрессию A2BR и ADA изучали методами вестерн-блоттинга, проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Было установлено, что A2BR и ADA экспрессируются в мембранах пристеночных клеток желудка, и показана высокая степень их колокализации, что особенно заметно в местах контакта поверхностей пристеночных клеток. Данные, полученные методами конфокальной микроскопии и проточной цитометрии, свидетельствуют о тесной ассоциации между A2BR и ADA, что, возможно, непосредственно связано с секреторной функцией железистых клеток.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: аденозиновый рецептор, аденозиндезаминаза, пуриновая сигнализация, клеточные мембраны, пристеночные клетки слизистой оболочки желудка.
Аденозин — регуляторный метаболит, пури-новый нуклеозид, регулирующий различные физиологические процессы. Большое количество аденозина продуцируется внутри клеток и секретируется наружу при повреждении тканей в ответ на метаболический стресс, гипоксию или ишемию [1]. Клеточными посредниками аденозина являются специфические аденози-новые рецепторы, ассоциированные с О-белка-ми [2].
Принятые сокращения: A2BR — аденозиновый рецептор типа A2B; ADA — аденозиндезаминаза; эктоADA — ADA, связанная с клеточной поверхностью; FITC — флуо-ресцеинизотиоцианат; п.н. — пары нуклеотидов.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-219, 28.12.2014.
** Адресат для корреспонденции.
Среди известных четырех типов аденозино-вых рецепторов (А1, А2А, А2В и А3) рецептор А2В (А2ВЯ) изучен менее всех и остается наиболее загадочным, поскольку обладает низким сродством к аденозину (ЕС50 ~24 мкМ) [2], и до сих пор обнаружено лишь несколько его специфических агонистов. В последнее время рецепторы этого типа привлекли большое внимание, поскольку была обнаружена их связь с процессами воспаления и канцерогенеза, а также обсуждалась возможность их использования в качестве мишеней для терапии с привлечением различных фармакологических препаратов [3]. Особенно примечательным является то, что при воспалительной ишемии внеклеточный уровень аденозина увеличивается до уровня, достаточного для активации А2ВЯ, а также то, что наблюдается транскрипционная регуляция А2ВЯ фак-
торами, задействованными в воспалительной гипоксии [4], что предполагает возможное участие A2BR в процессе контроля воспаления при гипоксии тканей [5].
Аденозиндезаминаза (ADA) — фермент, присутствующий во внутри- и внеклеточных компарт-ментах, который катализирует необратимое де-заминирование аденозина и превращение его в инозин. Внеклеточная ADA обладает способностью взаимодействовать с клеточной поверхностью и является секретируемым экзофермен-том [6, 7]. Связанная с клеточной поверхностью ADA (эктоADA) выполняет разнообразные функции и, помимо деградации аденозина, способна выступать в качестве дополнительного стимулятора в некоторых регуляторных процессах, а также функционировать как коммуникационный мостик между клетками [8]. В качестве «якорных» молекул для ADA выступают аде-нозиновые рецепторы A1, A2 и A2B, а также широко распространенный белок CD26 (дипепти-дилпептидаза 4) [9, 10]. С другой стороны, эк-toADA принимает участие в модуляции переноса сигнала путем взаимодействия с аденозино-выми рецепторами A1 и A2B [9]. Некоторыми авторами были описаны тесные взаимоотношения между ADA и A2BR, особенно когда эти два белка были одновременно экспрессированы на поверхности клеток [11, 12].
Ранее было установлено, что аденозин и его аналоги стимулировали секрецию кислоты изолированными железами и пристеночными клетками слизистой оболочки желудка кролика [13—15]. Секреция желудочной кислоты (0,5%-ные HCl, KCl, NaCl) пристеночными клетками зависит от выделения ионов Cl- некоторыми типами клеток слизистой желудка; показано, что функция переноса хлорида регулируется A2BR в других типах клеток. Известно, что в эпителии кишечника человека связывание аденозина с A2BR приводит к активации электрогенного выброса ионов Cl- при воспалении [16]. В клетках эпителия толстого кишечника A2BR экспрессированы в люминальных и базолатеральных мембранах, где они стимулируют секрецию хлоридов [17]. Кроме того, аденозин может воздействовать на A2BR апикальных мембран, чтобы напрямую стимулировать секрецию хлорида через посредство особого белка (cystic fibrosis conductance regulator protein) в клетках мышей линии mlMCD-K2, являющихся моделью почечных медуллярных собирающих канальцев [18].
Наше исследование ставило своей целью установить, экспрессируется ли A2BR на мембранах пристеночных секретирующих кислоту клетках слизистой оболочки желудка и колока-лизуется ли он с ADA.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изоляция пристеночных клеток из слизистой оболочки кишечника кролика. В работе были использованы Новозеландские кролики (самцы и самки) весом 2,5-4 кг. Содержание животных и все экспериментальные процедуры выполняли в соответствии с Испанскими (RD 1201/2005) и Европейскими (2003/65/CE и 2007/526/CE) правилами работы с лабораторными животными. Кроликов усыпляли введением анестетика пен-тобарбитала. Слизистую оболочку желудка получали, как описано в работе Берглинд и Об-ринк [19]: желудки перфузировали буфером PBS, рассекали и соскабливали слизистую. Клетки слизистой оболочки желудка изолировали по методу Фрейкланд с соавт. [20] в модификации Ейдз с соавт. [13]. Пристеночные клетки очищали путем элютриационного центрифугирования, как описано ранее [21]. Жизнеспособность клеток определяли с использованием трипанового синего (90-95% живых клеток в препаратах). Функциональную способность клеток определяли по измерению уровня секреции соляной кислоты в ответ на стимуляцию 10—3—10-7 M гистамином (данные не представлены).
Получение лишенных аденозина плазматических мембран проводили по методу Муаллема с соавт. [22] с некоторыми модификациями. Клетки (60 х 106 на 1 мл) гомогенизировали в 20 мМ Tris-HCl-буфере (pH 7,4), содержавшем 250 мМ сахарозу, 0,5 мМ ЭДТА, 0,54 мМ дитио-треитол, 5 мкг/мл леупептина, 15,7 мкг/мл бен-замидина, в гомогенизаторе Поттера. Суперна-тант (700 мл) наслаивали на 47%-ную сахарозу и центрифугировали в бакет-роторе при 100 000 g в течение 45 мин при 4°. Фракцию плазматических мембран собирали с границы раздела фаз, ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4) и центрифугировали при 120 000 g в течение 20 мин при 4°. Затем мембраны инкубировали с ADA (2 ед/мл) в течение 1 ч при комнатной температуре для разрушения эндогенного аденозина. Препарат мембран хранили в том же буфере при —80°.
Иммуноокрашивание: проточная цитометрия и конфокальная микроскопия. Процедуру окрашивания клеток проводили, как описано в работе Мирабет с соавт. [11]. Нативные пристеночные клетки (4 х 106 в буфере PBS, рН 7,4) обрабатывали 2%-ным параформальдегидом (w/v) в присутствии 60 мМ сахарозы в течение 15 мин при комнатной температуре. Клетки промывали буфером PBS, содержавшим 20 мМ глицин, а затем блокировали 1%-ным БСА. Иммуноокра-шивание проводили с использованием кроличьих антител против A2BRчеловека [11] или против ADA человека [23]. В качестве вторичных анти-
тел использовали FITC-конъюгированные антикроличьи IgG («Boehringer Mannheim», Германия). Первичные антитела были получены и любезно предоставлены проф. Р. Франко из Барселонского университета (Испания). Проточный цитометрический анализ выполняли с помощью проточного цитометра EPICS Profile («Coulter Corporation», США). Отбор клеточных субпопуляций проводили путем оценки значений фронтального (FS) и латерального (SS) светорассеяния. Сортировку клеток осуществляли с помощью оборудования EPICS Profile.
При конфокальной микроскопии клетки окрашивали так же, как и при проточной цито-метрии, но для визуализации ADA были использованы TRITC-конъюгированные вторичные антитела («Boehringer Mannheim», Германия). Клетки были заключены в среду Immuno-Fluore и сканированы с использованием конфокального сканирующего лазерного микроскопа Leica TCS 4D, соединенного с инвертированным микроскопом Leitz DMIRBE («Leica Lasertechnik GmbH», Германия). Анализ колокализации выполняли с использованием программы Multi Color version 2.0 («Leica Lasertechnik GmbH», Германия).
Анализ мРНК методом ОТ-ПЦР. Тотальную РНК экстрагировали из 1 х 107 клеток с использованием Trizol Reagent («Invitrogen», Испания), кДНК получали путем обратной транскрипции (SuperScript II RT, «Invitrogen», Испания) в соответствии с инструкцией производителя. Обнаружение мРНК A2BR, кодируемой геном ADORA2B, выполняли путем детекции конечных продуктов ПЦР с использованием двух пар прайм еров: 5 ' -CGTTCCATGCCATCAACTG/TTGACATC-C
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.