КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2007, том 52, № 3, с. 554-559
^ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^
СИСТЕМЫ
УДК 577.352.2+538.9
КОМБИНИРОВАННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ НЕЙТРОННОГО И СИНХРОТРОННОГО ИЗЛУЧЕНИЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА НА СТРУКТУРУ И СВОЙСТВА МЕМБРАНЫ ДИПАЛЬМИТОИЛФОСФАТИДИЛХОЛИНА
© 2007 г. М. А. Киселёв
Объединенный институт ядерных исследований, Дубна E-mail: kiselev@jinr.ru Поступила в редакцию 17.10.2006 г.
Исследовано влияние диметилсульфоксида (ДМСО) на структуру и свойства мембраны дипальми-тоилфосфатидилхолина при положительных температурах методом комбинированного применения рентгеновской дифракции и малоуглового рассеяния нейтронов. Установлено, что проникновение молекул ДМСО в липидную мембрану зависит от мольной фракции ДМСО в водном растворе -^дМСО. При ХдмСО > 0.08 группа SO проникает в полярную область бислоя, вызывая изменения в его структуреГПри ХдМСО > 0.2 молекулы ДМСО развивают дефекты в мембранной поверхности.
PACS: 87.14.Cc, 87.16.Dg
ВВЕДЕНИЕ
Диметилсульфоксид (ДМСО) широко применяется как криопротектор в криобиологии для хранения биологической ткани при низких температурах [1-3]. Обладая высокой проницаемостью через биологические мембраны, ДМСО применяется в медицине и ветеринарии для переноса лекарств через кожный покров [4]. Предлагается также использование ДМСО в интенсивной терапии критических состояний [5]. ДМСО применяется в клеточной биологии как растворитель для лекарств [2]. Широта практического применения ДМСО, естественно, вызывает интерес к исследованию на молекулярном уровне влияния водных растворов ДМСО на белки, биологические мембраны и модельные биологические мембраны (фосфолипиды). Влияние ДМСО на свойства модельных биологических мембран представляет интерес как с точки зрения изучения криопротек-торных свойств [6], так и с точки зрения понимания механизма проникновения молекул ДМСО через биологическую мембрану. Задача охлаждения биологической ткани без ее разрушения кристаллами льда сводится к двум противоречивым требованиям. С одной стороны, необходимо охлаждать систему как можно быстрее, поддерживая воду в переохлажденном состоянии, а с другой - требуется, чтобы свободная вода до начала кристаллизации продиффундировала из биологической ткани в окружающий физиологический раствор. При этом оставшаяся в биологическом объекте связанная вода не представляет опасности, так как она не превращается в кристалл, а остается в аморфном состоянии, остекловываясь при темпе-
ратурах жидкого азота. Для удовлетворения этих условий цикл охлаждения разбивается на две быстрые части с остановкой охлаждения между ними. При остановке охлаждения переохлажденная свободная вода должна успеть продиффунди-ровать в физиологический раствор и при дальнейшем охлаждении закристаллизоваться в нем. Мультислойные везикулы фосфолипидов представляют достаточно хорошую модель для исследования таких процессов (рис. 1) [6, 7, 15], так как, находясь в избытке свободной воды, они содержат внутри себя воду как свободную, так и связанную водородными связями с поверхностью мембраны [6, 8]. На рис. 2 схематично изображено деление воды в межмембранном пространстве на свободную воду, которая обладает свойствами
Рис. 1. Сечения мультислойной (слева) и однослойной (справа) везикулы ДПФХ в избытке воды. Мульти-слойная везикула состоит из бислоев липида, разделенных прослойкой воды. Поверхностью однослойной везикулы является бислой (мембрана) [7].
обычной воды в большом объеме, и на воду, связанную с поверхностью мембраны. В свою очередь, связанная вода делится на молекулы воды, расположенные в области полярных голов мембраны, и на молекулы воды, находящиеся у мембранной поверхности.
В [9] исследовано влияние ДМСО при малых концентрациях (мольная фракция ДМСО в воде, ХдМСО, не превышала 0.13) на три типа фосфоли-пидов: димиристоил-, дипальмитоил-, дистеаро-ил-фосфатидилхолин (ДМФХ, ДПФХ, ДСФХ). Было установлено, что при увеличении концентраций ДМСО происходит: уменьшение периода повторяемости мембраны ё (например, для ДПФХ с 63.6 до 60.4 А при ХДМСО = 0.11 и Т = 25°С); линейное увеличение температуры главного фазового перехода и предперехода; постепенное их сближение и исчезновение предперехода. Вычисленные из дифракционных экспериментов профили плотности распределения электронов (фурье-профили) демонстрировали увеличение расстояния между максимумами ёрр с 41.3 до 43.5 А. Широкоугловая рентгеновская дифракция (ШУРД) не выявила влияния ДМСО на упаковку углеводородных хвостов липидных молекул. Исходя из этого, было сделано предположение, что молекулы ДМСО располагаются около поверхности мембраны и тем самым, за счет атомов серы, эффективно влияют на плотность распределения электронов. В [10] было исследовано влияние ДМСО на структуру мембран ДПФХ во всем диапазоне концентраций, от ХцМСО = 0 до ХдМСО = 1. Результаты в области малых концентраций хорошо совпадают с данными в [9]. Было обнаружено, что при приближении к ХдМСО = 1 (чистое ДМСО) происходит переход мембраны в фазу с взаимным проникновением углеводородных цепочек из противоположных слоев бислоя (ЬрГфаза). При этом резко - до (77 ± 1)°С увеличивается температура фазового перехода в жидкокристаллическую фазу. Из анализа ШУРД было показано, что молекулы ДМСО проникают в область полярных голов при средних и высоких концентрациях. Фазовая диаграмма мембраны ДПФХ для ХДМСО е [0, 0.2] построена в [11]. Рассчитанные в [11] профили плотности распределения электронов демонстрировали их независимость от концентрации ДМСО. Был сделан вывод об отсутствии влияния ДМСО на толщину мембраны, который противоречил экспериментальным результатам [9] и расчетам методом молекулярной динамики [14].
Наиболее важные изменения в структуре и свойствах тройной системы ДПФХ/дМСО/вода происходят в области малых концентраций 0.0 < < ХдМСО < 0.3. В этом интервале концентраций температура главного фазового перехода увеличивается от (41.7 ± 0.2) до (50.6 ± 0.2)°С, предпереход исчезает, толщина прослойки растворителя в межмембранном пространстве уменьшается от
Область
полярных голов »
Связанная вода
Свободная вода
I Связанная вода
Область полярных голов
Рис. 2. Схематическое изображение межмембранного пространства мультислойной везикулы в гель Ь^-фазе. Углеводородные хвосты наклонены относительно нормали к поверхности мембраны [8].
(14.4 ± 1.8) À при ХдмСО = 0.0 до (7.8 ± 1.8) À при
Хт
ДМСО
= 0.1 [8, 10]. Уменьшение величины (ДМСО индуцированная дегидратация) соответствует уменьшению числа молекул свободной воды в межмембранном пространстве: при ХдМСО = 0.14 только (1.1 ± 0.4) молекул свободной воды на молекулу ДПФХ существует в межмембранном пространстве [8].
Данная работа посвящена результатам, полученным методом рентгеновской дифракции и малоуглового рассеяния нейтронов при изучении тройной системы ДПФХ/дМСО/вода в области малых концентраций криопротектора, ХцМСО < 0.2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ДПФХ, ДМСО были приобретены в компаниях "Sigma" и "Aldrich" (Париж) соответственно. H2O (18 МОм см) производилась на установке "Milli-pore", D2O приобретено в объединении "Изотоп" (Санкт-Петербург). Для дифракционных экспериментов на синхротроне мультислойные везикулы из ДПФХ с различной концентрацией ДМСО в H2O приготовлялись в кварцевых капиллярах [8]. Однослойные везикулы из ДПФХ для экспериментов по малоугловому рассеянию нейтронов приготавливались в дейтерированном ДМСО и воде [13]. Эксперименты по малоугловой дифракции рентгеновских лучей на мультислойных везикулах выполнены в LURE, Orsay, Франция, на малоугловом спектрометре D24 синхротронного источника DCI [17]. Эксперименты по малоугловому рассеянию нейтронов на однослойных везикулах из ДПФХ были выполнены на малоугловом спектрометре ЮМО импульсного реактора ИБР-2, Дубна [18].
556
КИСЕЛЕВ
I, отн. ед. 103
101
0.6
q, А-1
р(х), отн. ед. 1.5
0
х, А
Рис. 3. Рентгеновские дифракционные спектры, записанные при 20°С от мультислойной структуры ДПФХ при Хдмсо = 0.0 и Хдмсо = 0.08. I - интенсивность рассеяния, q - вектор рассеяния.
Рис. 4. Распределение плотности электронов р(х) в направлении нормали к бислою для Хдмсо = 0.0 (сплошная кривая) и Хдмсо = 0.05 (пунктирная кривая), .х - расстояние от центра бислоя.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 3 представлены дифракционные спектры, полученные при рассеянии рентгеновских лучей на мультислойных везикулах ДПФХ с ХдМСО = 0 и 0.08. Важно отметить, что с увеличением концентрации ДМСО количество дифракционных максимумов уменьшается с пяти до четырех, что снижает точность вычисления плотности распределения электронов р(х) в направлении, перпендикулярном плоскости бислоя. После вычитания фона модуль структурного фактора F вычисляется по значению интегральной интенсивности 1г дифракционного пика:
F = iji,, (1)
где i - порядок дифракционного отражения. Знак структурного фактора Fi определялся в соответствии с процедурой, описанной в [9-12]. Величина р(х) получается при фурье-преобразовании структурных факторов F в соответствии с выражением
n
p(x) = ^ Fi cos (2 п ix/d), (2)
i = 0
где n - количество измеренных дифракционных пиков.
На рис. 4 и 5 представлены профили распределения плотности электронов в мембране ДПФХ (фурье-профили) для ХДМСО = 0; 0.05; 0.08; 0.10. Фурье-профили отражают структуру мембраны в направлении нормали к ее поверхности, за начало
отсчета принят центр бислоя. Максимумы в районе 20-22 А соответствуют положению фосфора в полярной голове молекулы ДПФХ. Расстояние между этими максимумами ^р характеризует толщину мембраны. Измеренные по фурье-профилям значения ^р представлены в табл. 1, из которой видно, что увеличение йрр на (2.8 ± 0.8) А происходит при ХдМСО = 0.05. При ХдМСО = 0.08
р(х), отн. ед. 1.5
0.5
_I_I_I_0
-30 -20 -10 0 10 20 30
х, А
Рис. 5. Распределение плотности электронов р(х) в направлении нормали к бислою для Хдмсо = 0.08 (сплошная кривая) и Хдмсо = 0.10 (пунктирная кривая), х - расстояние от центра бислоя.
величина ёрр достигает максимума и затем при ХдМСО = 0.1 происходит ее уменьшение. Следует отметить, что увеличение концентрации ДМСО
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.