научная статья по теме КОМПАКТИЗАЦИЯ ДНК В СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА. I. ДИНАМИКА КОМПАКТИЗАЦИИ НУКЛЕОГИСТОННОГО И НУКЛЕОПРОТАМИННОГО ХРОМАТИНА В ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХСЯ СПЕРМАТИДАХ Биология

Текст научной статьи на тему «КОМПАКТИЗАЦИЯ ДНК В СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА. I. ДИНАМИКА КОМПАКТИЗАЦИИ НУКЛЕОГИСТОННОГО И НУКЛЕОПРОТАМИННОГО ХРОМАТИНА В ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХСЯ СПЕРМАТИДАХ»

ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 2, с. 143-153

= ГАМЕТОГЕНЕЗ

УДК 591.3:576.315.42

КОМПАКТИЗАЦИЯ ДНК В СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА. I. ДИНАМИКА КОМПАКТИЗАЦИИ НУКЛЕОГИСТОННОГО И НУКЛЕОПРОТАМИННОГО ХРОМАТИНА В ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХСЯ СПЕРМАТИДАХ

© 2012 г. Е. А. Арифулин1, Е. Е. Брагина2, В. А. Замятнина2, Е. Г. Волкова1, Е. В. Шеваль2, С. А. Голышев2, Л. Н. Кинцурашвили2, Г. И. Кирьянов2, А. Н. Прусов2, В. Ю. Поляков2

1 Факультет биоинженерии и биоинформатики, МГУ им. М.В. Ломоносова 119991 Москва, Воробьевы горы, д. 1, стр. 73 2 НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, МГУ 119991 Москва, Воробьевы горы, д. 1, стр. 40 E-mail: sergei.golyshev@mail.genebee.msu.ru Поступила в редакцию 04.05.10 г.

Окончательный вариант получен 20.01.11 г.

В работе изучена динамика изменений структуры хроматина на различных стадиях дифференци-ровки сперматид человека. Показано, что в ядрах ранних сперматид хроматин полностью деком-пактизован, его структурной единицей является фибрилла толщиной около 8 нм. На начальных стадиях дифференцировки эта "элементарная" фибрилла является преобладающей структурой в ядрах, а на последующих этапах она постепенно замещается крупными глобулярными комплексами диаметром около 60 нм. В дальнейшем глобулы ассоциируют в фибриллярные структуры, толщина которых уменьшается до 30—40 нм. На всех стадиях дифференцировки, кроме конечных, глобуляр-но-фибриллярные комплексы представляют собой центры ассоциации элементарных фибрилл. Процесс конденсации хроматина имеет векторный характер — он направлен от апикальной зоны ядра к базальной. В зрелых сперматидах преобладающим компонентом являются фибриллы толщиной около 40 нм, тонкие фибриллы практически отсутствуют. По своей структурной организации ядра зрелых сперматид полностью соответствуют ядрам сперматозоидов с "незрелым" хроматином, которые в небольшом количестве обнаруживаются в эякуляте здоровых доноров и могут преобладать над нормальными клетками при паталогиях спермиогенеза. Причина такой остановки дифференцировки остается непонятной. Возможно, в части сперматид блокируется формирование межмолекулярных дисульфидных связей, которые необходимы для завершающей фазы компактизации генома. Полученные результаты обсуждаются в связи с известными моделями организации нук-леопротаминового хроматина в сперматозоидах человека.

Ключевые слова: хроматин, ДНК, спермиогенез, сперматиды, гистоны, протамины, надмолекулярная организация.

Используемые сокращения: ДНП — дезоксири-бонуклеопротеид, PBS — Phosphate Buffered Saline (солевой раствор с фосфатной буферной системой по Дюльбекко), TUNEL — Terminal dUTP Nick End Labelling (мечение разрывов концевым присоединением dUTP), DAPI — 4',6-diamidino-2-phenylin-dole (4',6-диамидино-2-фенилиндол).

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что геном эукариот имеет сложную иерархическую организацию, которая обеспечивается специфическим взаимодействием ДНК с различными классами белков.

В соматических клетках "низший" уровень компактизации создается за счет взаимодействия

ДНК с тетрамером гистонов (Н2А, Н2В, Н3 и Н4), в результате формируются "элементарные" ДНП фибриллы, состоящие из дискретных нуклеопро-теиновых частиц — нуклеосом (Richmond, Davey, 2003). Другой представитель гистонов — белок Н1 — компактизует "элементарные" нуклеосомные фибриллы в ДНП-фибриллы толщиной около 30 нм (Thoma et al., 1979; Van Holde, 1988). В ряде работ описаны более высокие уровни организации хроматина соматических клеток эукариот (Ченцов, Поляков, 1969; Belmont, Bruce, 1994 Sheval et al., 2002; Ченцов, Бураков, 2005), однако молекулярные механизмы, обеспечивающие их формирование, остаются малоизученными.

В процессе формирования мужских гамет у многих представителей эукариот каноническая

нуклеогистоновая организация хроматина соматических клеток практически полностью перестраивается (ремоделируется) на молекулярном и структурном уровне.

Ремоделирование хроматина — многоступенчатый процесс, который инициируется на ранних стадиях дифференцировки сперматид и завершается после прохождения сперматозоидов через эпидидимис (Oliva, 2006). На начальных этапах дифференцировки соматический тип гистонов или их тестис-специфических вариантов замещается транзиторными белками (ТР1 и ТР2), которые затем заменяются протаминами (Maistrich et al., 2002). В геноме человека в эквивалентных количествах экспрессируется два протамина — Р1 и Р2. Прота-мины представляют собой основные и строго специфические для спермиогенеза белки, они имеют домены, богатые аргинином и цистеином. Высокий уровень аргинина создает положительный заряд молекул белков, что обеспечивает эффективное связывание протаминов с ДНК. Остатки цистеина участвуют в формировании многочисленных внутренних и внешних дисульфидных связей, необходимых для компактной упаковки ДНК в хроматине сперматозоидов (Carell et al., 2007).

В настоящее время в области изучения ремоде-лирования хроматина достигнут существенный прогресс, однако представления о макромолеку-лярной организации нуклеопротаминовых комплексов в хроматине сперматозоидов остаются во многом гипотетическими. По одной из гипотез фундаментальными структурными единицами нуклеопротаминового хроматина являются торои-ды — кольцевые структуры толщиной около 20 нм, с внешним диаметром около 90—100 нм и внутренним диаметром около 15 нм (Hud et al., 1993). Основу тороидов составляют петлевые домены ДНК (средний размер около 46 kb), линкеры между индивидуальными тороидами ассоциированы с белками ядерного матрикса (Ward, Ward, 2004). Главный недостаток этой модели состоит в том, что формирование тороидальных структур наиболее убедительно продемонстрировано в системе in vitro (Allen et al., 1996). Существование тороидов в "на-тивном" или искусственно декомпактизованном хроматине сперматозоидов не документировано. Кроме того, в некоторых работах показано, что нуклеопротаминовй хроматин имеет не тороидальную, а, скорее, иерархическую фибриллярно-глобулярную организацию (табл. 1). Имеются также данные о наличии в хроматине сперматозоидов крупных ДНК-содержащих сферических комплексов диаметром около 300 и 500 нм (табл. 1).

Отсутствие хорошо обоснованной и общепринятой модели структурной организации нук-леопротаминовых комплексов означает, что многочисленные данные по анализу молекулярных преобразований генома в условиях его ремодели-

рования трудно сопоставимы с представлениями о структурной реорганизации хроматина, сопровождающими этот процесс. Исследования в этой области представляют большой интерес не только в теоретическом плане. Показано, что нарушения в компактизации хроматина в сперматозоидах человека могут приводить к существенным нарушениям в нормальном развитии беременности, вплоть до ее преждевременного прерывания (Бра-гина и др., 2009).

Цель настоящей работы — изучение уровней организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека. Для электронно-микроскопического и иммуноцитохимического анализа использовали сперму здоровых доноров и инфер-тильных пациентов, в эякуляте которых обнаруживаются нормальные сперматозоиды и сперма-тиды, находящиеся на различных стадиях дифференцировки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА Тестирование жизнеспособности сперматозоидов

Суспензии сперматозоидов здоровых доноров и инфертильных пациентов (предоставлены для исследования клиникой "Альтравита", г. Москва) инкубировали по стандартной методике 15 мин при 37°С. Каплю суспензии помещали на предметное стекло, смешивали с водным раствором эозина (1%) и определяли долю клеток, окрашенных эозином (мертвые клетки).

Детектирование разрывов ДНК в хроматине сперматозоидов

Высушенные мазки очищенной спермы хранили при —20°С. Перед экспериментом мазки фиксировали 15 минут при комнатной температуре 4%-ным раствором формальдегида на PBS. Промывали образцы в двух сменах PBS по 5 минут каждая. Пермеабилизировали клетки 0.2% р-ром Triton X-100 на PBS 5 минут при комнатной температуре. Обрабатывали образцы раствором протеи-назы К (20 мкг/мл) на PBS 10 минут при комнатной температуре. После обработки протеиназой К образцы промывали в PBS 5 минут при комнатной температуре. Дополнительно фиксировали клетки формальдегидом. Для выявления разрывов ДНК использовали набор DeadEnd Fluorimetric TUNEL system (Promega), согласно инструкции произов-дителя. После завершения ферментативной реакции образцы докрашивали DAPI (1 мкг/мл) на PBS 10 минут, отмывали излишки флуорохрома 10 минут в PBS при комнатной температуре, заключали образцы в MOVIOL (Calbiochem) и изучали на флуоресцентном микроскопе с использованием объектива 100х NA 1.3.

Данные о структуре хроматина сперматозоидов по данным литературы

Автор Структуры хроматина Метод исследования Модельный объект

Wagner, Yun, 1979 Глобулярные структуры диаметром около 40 и 15 нм Искусственная деконденсация, электронная микроскопия человек

Sobhon et al., 1981 Палочковидные структуры толщиной 45—100 нм и соединяющие их фибриллы, толщиной около 25—29 нм Деконденсация мочевиной и дитиотрейтолом и микрококковой нуклеазой крыса

Sobhon et al., 1982 Глобулярные фибриллы толщиной 90—120 и 38—52 нм, фибриллы толщиной 18—21 и 12—15 нм Деконденсация саркозилом и ди-тиотрейтолом, трансмиссионная электронная микроскопия человек

Sobhon et al., 1982 Глобулярные фибриллы толщиной 33— 42 и 65—120 нм и соединяющие их фибриллы толщиной 6—8 нм Деконденсация микрокковой нук-леазой и 2 М №С1, трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия человек

Allen et al., 1993 Глобулярные структуры диаметром 50 и 100 нм Искусственная деконденсация, атомный силовой микроскоп бык, мышь, крыса

Hud et al., 1993 Тороид, внешний диаметр 90 нм, внутренний — 15 нм, толщина 20 нм Деконденсация дитиотрейтолом, атомный силовой микроскоп, трансмиссионный электронный микроскоп бык

Haaf, Ward, 1995 Глобулярные структуры диаметром около 300 нм Спридинг ДНК, световая микроскопия, окраска БАР1 человек

Mudrak et al., 2006 Хромосома толщиной 1000 нм, состоящая из глобул 500 нм Гибридизация ДНК, световая микроскопия человек

Worawittayawong et al., 2008 Ранние сперматиды — фибриллы толщиной 10—30 нм,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком