ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 6, с. 896-904
УДК 581.1
КОМПАРТМЕНТАЦИЯ a- И Р-КАРБОАНГИДРАЗ В КЛЕТКАХ ГАЛО-И АЛКАЛОФИЛЬНОЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ Rhabdoderma lineare
© 2004 г. М. В. Дудоладова, А. Г. Маркелова, Н. В. Лебедева, Н. А. Пронина
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 21.06.2004 г.
С помощью вестерн-блот-анализа и иммуноэлектронной микроскопии исследована организация системы карбоангидраз (КА) у гало- и алкалофильной цианобактерии Rhabdoderma lineare. Показано наличие экстрацеллюларной а-КА (60 кД) в гликокаликсе, окружающем клетку плотным чехлом, а также двух внутриклеточных Р-КА. Одна Р-КА (60 кД) ассоциирована с полипептидами ФС II и является конститутивным ферментом. Вторая, индуцируемая низким содержанием бикарбоната в среде культивирования, индуцибельная Р-КА (25 кД), обнаружена во фракции суммарных растворимых белков. Экспрессия синтеза индуцибельной Р-КА сопровождается увеличением внутриклеточного пула неорганического углерода, что свидетельствует о важной роли этого фермента в функционировании СО2-концентрирующего механизма.
Rhabdoderma lineare - алкалофилъные цианобактерии содовых водоемов - а- и Р-карбоангидразы -фотосистема II - тилакоидные мембраны - С02-концентрирующий механизм
Карбоангидраза (КА, карбонатгидролиаза, КФ 4.2.1.1.) со времени своего открытия в клетках эритроцитов двумя независимо работающими исследовательскими группами [1, 2], обнаружена у большинства организмов самого разнообразного уровня организации, включая животных [3], растения и микроводоросли [4, 5], архе- и эубак-терии [6]. Доказано участие фермента в таких фундаментальных процессах, как фотосинтез, дыхание, транспорт соединений неорганического углерода (С;) и ионов, кальцификация и регуляция кислотно-щелочного баланса [3-8].
Согласно современной систематике, все КА подразделяют на три основных класса (а, в, у), не имеющих между собой значимой гомологии в аминокислотных последовательностях и эволюционировавших, вероятно, независимо друг от друга [7]. КА отличаются разнообразием не только по структуре и физиологическим функциям, но и по локализации в клетке. Ферменты обнаружены в клеточной оболочке [9, 10], периплазма-тическом пространстве [11], цитоплазме [12] и большинстве клеточных компартментов, таких, например, как хлоропласты, митохондрии и кар-боксисомы [5, 13]. Примечателен такой феномен,
Сокращения: ССМ - С02-концентрирующий механизм; Cj -
_ -2
соединения неорганического углерода (СО2, НСO3, СО3 ); КА - карбоангидраза / зы.
Адрес для корреспонденции: Пронина Наталья Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: npronina@ippras.ru
как присутствие нескольких форм КА в одной клетке.
У цианобактерий среди представителей ферментов а-класса в настоящее время известны пе-риплазматические КА АпаЬаепа ер. РСС 7120 и ВупвсНососсш ер. РСС 7942, кодируемые геном есаА [14]. Эти внеклеточные КА, вероятно, участвуют в образовании субстратов (С02 или НС О-) для цитоплазматических переносчиков С; или же играют роль сенсора уровня С02 в окружающей среде [8]. Недавно было выявлено присутствие внеклеточной а-КА в гликокаликсе алкалофильной цианобактерии М(сгосо1еш chthonoplastes [9, 10]. Авторы предполагают, что помимо участия в утилизации бикарбоната и карбоната для фотосинтетической ассимиляции С02, этот фермент важен для минерализации цианобактерий, образующих известковый скелет.
В клетках Бупе^ососсш РСС 7942 был выявлен также ген (с/А, кодирующий в-КА [13, 15]. Впоследствии, гомологичный по многим параметрам белок, продукт гена ссаА, был обнаружен и у Synechocyst(s РСС 6803 [8]. Эти КА принимают активное участие в С02-концентрирующем механизме (ССМ). Они ассоциированы с карбоксисо-мами - особыми компартментами, содержащими ключевой фермент фиксации С02 - РБФК - и участвуют в генерации диоксида углерода из бикарбоната. В клетках Synechocyst(s РСС 6803 была обнаружена еще одна в-КА ЕеаБ [8], точная локализация которой в клетке не выяснена. Но наличие у есаВ сайта связывания с липопротеина-
ми свидетельствует о том, что продукт этого гена может быть локализован в цитоплазматической мембране или периплазме. Кажется вероятным, что подобно ферменту Р-типа ЕсаА Synechococcus PCC 7942, EcaB также участвует в транспорте C¡ [6, 8], обеспечивая субстратами функционирование ССМ.
Третий класс ферментов цианобактерий, у-КА, представлен продуктами ряда генов ccm, выделенных из Synechococcus sp. PCC 7942 и сходных по аминокислотным последовательностям с белками из Synechocystis PCC 6803 и Synechococcus РСС 7002 [16, 17]. Члены ряда ccm необходимы клетке Synechococcus для роста при низких концентрациях С02 и для правильной сборки карбок-сисом [16]. Известно, что продукт одного из них, ëcmM, локализован в карбоксисоме [17]. Предполагаемая роль этого белка - предотвращение утечки С02 из карбоксисомы.
Крайне перспективными объектами для изучения автотрофной ассимиляции C¡ и, в частности, участия в этом процессе КА, являются алка-лофильные цианобактерии содовых озер [9, 10]. С эволюционной точки зрения, они примечательны тем, что, вероятно, являются реликтами древней наземной микробиоты, сохранившейся в экстремальных условиях обитания [18]. Таким образом, исследование организации КА системы у этих организмов может представлять интерес для понимания эволюции трех классов КА. Помимо этого, способность расти при сильнощелочных значениях рН (9-10), а значит, в присутствии исключительно карбонатных и бикарбонатных форм неорганического углерода [19], позволяет более определенно говорить о поглощаемой клетками форме C¡ и о роли КА в этом процессе.
Ранее нами у трех представителей цианобакте-риального сообщества содовых озер, в том числе и у реликтовой гало- и алкалофильной Rhabdoder-ma lineare, была обнаружена высокая активность КА. B настоящей работе проведена идентификация классов КА R. lineare, исследована их локализация, а также изучено влияния концентрации бикарбоната на экспрессию синтеза КА и на изменение внутриклеточного пула C¡ с целью изучения роли КА в работе ССМ.
МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовали экстремальную гало- и алкалофильную циано-бактерию Rhabdoderma lineare из коллекции Института микробиологии РАН, выделенную из гиперсоленого африканского содового оз. Магади [19].
Культуру выращивали в накопительном режиме в стерильных условиях на среде S [18], рН 9.59.8, при температуре 20°С и освещении люминесцентными лампами 30 Вт/м2. Для изучения влия-
ния содержания бикарбоната на активность и локализацию КА использовали модификации среды S с пониженным содержанием NaHCO3. В стандартной среде S концентрация этого вещества составляла 16.8, в модифицированных вариантах - 8.4 и 0.84 (г / л).
Разрушение клеток проводили в фосфатном буфере следующего состава: 0.06 М Na2HPO4, 5 мМ цистеина, 1 мМ ЭДТА, рН 8.1, на холоду в гомогенизаторе "Retch-MMW" (Германия) со стеклянными бусами при соотношении буфер : бусы -1 : 1. Разделение гомогената на фракции растворимых белков и нерастворимых компонентов клетки, содержащих клеточные мембраны, проводили с помощью центрифугирования при 100000 g (1 ч, 4°С) на центрифуге Beckman (Германия).
Активность КА определяли электрометрическим способом с помощью рН-метра М-901 ("Orion", США) по изменению концентрации Н+ в реакции гидратации диоксида углерода [20]. Реакционная смесь содержала интактные клетки, отмытые от культуральной среды, или суммарный гомогенат (0.5-0.8 мг белка) в фосфатном буфере. Реакцию инициировали быстрым введением 2 мл насыщенного водного раствора С02 в равный объем реакционной среды и проводили при 2°С. Активность КА рассчитывали в условных единицах Вильбура-Андерсена на мг белка по изменению начальной скорости реакции. Контролем служила неферментативная реакция. Измерение скорости реакций проводили в 5-7-кратной повторности.
Содержание белка определяли по методу Low-ry [21].
Содержание хлорофилла измеряли спектро-фотометрически в метанольных экстрактах [22].
Электрофоретическое разделение полипептидов проводили в денатурирующих условиях в 12%-ном геле полиакриламида [23]. Денситомет-рию гелей проводили на приборе Chromatogramm densitometer CD-50 ("Desaga", Германия) при длине волны 450 нм.
Вестерн-блот-анализ осуществляли, согласно протоколу Bio-Rad Laboratories с использованием стандартных реагентов. В качестве первичных антител использовали афинно очищенные антитела против ß-КА из Coccomyxa sp., или а-КА (Cah3) из C. reinhardtii, любезно предоставленные проф. Samuelsson (Umea University, Швеция). В качестве вторичных антител использовали антикроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена ("Amersham Life Science", Великобритания). Специфическое связывание визуализировали, используя хемолюминесцентные растворы (ECL, "Amersham Life Science").
Выделение тилакоидных мембран осуществляли центрифугированием мембранной фракции в ступенчатом градиенте плотности сахарозы [20].
кД 97
66
45
30
20.1 —
14.4 —
Рис. 1. Вестерн-блот-анализ суммарной белковой фракции клеток КкаЪйойегша Ипеаге. В реакции иммуногибридизации использовали 20 мкг белка суммарного гомогената и антитела к Р-КА Сос-сошуха зр. (1) или антитела тилакоидной а-КА (СаИ 3) С. гвткагЖи (2).
Внутриклеточный пул Q определяли с помощью метода фильтрационного центрифугирования через слой силиконового масла [26], модифицированного для исследуемой культуры. Клетки, выращенные на средах с различными концентрациями NaHC03, центрифугировали при 4000 g (20 мин, 25°C) на центрифуге К-23 (Германия) и отмывали от среды фосфатным буфером. Далее пробы преинкубировали на свету (30 Вт/м2, 1 ч) в фосфатном буфере. По 20 мкл суспензии переносили в пластиковые пробирки (200 мкл), содержащие в качестве нижнего слоя 10%-ный КОН в абсолютном метаноле и наслоенную на этот раствор смесь силиконовых масел AR200 : DC200 ("Fluka", Швеция) в соотношении 2 : 3 по объему. Поглощение Q инициировали внесением NaH14C03 (молярная активность 18.8 Q/моль) до конечной концентрации 10 мкМ, при те
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.