научная статья по теме КОМПЕНСАТОРНОЕ УМЕНЬШЕНИЕ ОБЪЕМА ДВУХКЛЕТОЧНОГО ЭМБРИОНА МЫШИ НЕ РЕГУЛИРУЕТСЯ NA+/K+ АТФАЗОЙ И ОТМЕНЯЕТСЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЦИТОХАЛАЗИНА Б Биология

Текст научной статьи на тему «КОМПЕНСАТОРНОЕ УМЕНЬШЕНИЕ ОБЪЕМА ДВУХКЛЕТОЧНОГО ЭМБРИОНА МЫШИ НЕ РЕГУЛИРУЕТСЯ NA+/K+ АТФАЗОЙ И ОТМЕНЯЕТСЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЦИТОХАЛАЗИНА Б»

ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 2, с. 94-102

БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

УДК 591.3.39:577.17.049:578.6.68

КОМПЕНСАТОРНОЕ УМЕНЬШЕНИЕ ОБЪЕМА ДВУХКЛЕТОЧНОГО ЭМБРИОНА МЫШИ НЕ РЕГУЛИРУЕТСЯ Na+/K+ АТФазой И ОТМЕНЯЕТСЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЦИТОХАЛАЗИНА Б

© 2012 г. М. А. Погорелова1, В. А. Голиченков2, А. В. Тарасов12, В. Н. Погорелова1,

А. И. Панаит1, А. Г. Погорелов13 *

1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН 2 Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова 3 Пущинской государственный университет, факультет биофизики и биомедицины

E-mail: agpogorelov@rambler.ru Поступила в редакцию 17.12.10 г. Окончательный вариант получен 02.03.11 г.

В данной работе, комбинируя лазерную микротомографию (LSM) и количественную трехмерную реконструкцию (3 DR), изучали изменение объема двухклеточного эмбриона мыши в течение гипо-осмотического стресса. Показано, что в широком диапазоне (150—230 мОсм) гипотонических условий развивается компенсаторная реакция (RVD — Regulatory Volume Decrease), направленная на восстановление объема эмбриональной клетки. В начальной фазе набухания, когда осмотический ответ бластомера соответствует закону Вант Гоффа, на интервале 5 минут анизотонического стресса уточнено значение для проницаемости воды через мембрану, которое составляет 0.3 мкм • • мин-1 • атм-1. Последующая фаза компенсаторного ответа ингибируется на фоне действия цито-халазина Б (Cyto B) и остается не чувствительна к действию оуабаина, специфического ингибитора №+/К+-АТФазы.

Ключевые слова: бластомер мыши, регуляторное уменьшение объема, цитоскелет, №+/К+-АТФаза, лазерная сканирующая микроскопия, трехмерная реконструкция.

Изменение объема клетки вызывает каскад компенсаторных ответов на молекулярном, мембранном и клеточном уровне (Hoffmann et al., 2009). Поддержание клеточного объема рассматривается как ключевой фактор в развитии раннего эмбриона млекопитающих (Van Winkle et al., 1990; Biggers et al., 1993; Fong et al., 2007; Baltz, Tartia, 2010). Для соматических клеток показано, что компенсаторный ответ по типу RVD может быть индуцирован механической деформацией цитоскелета (Hoffmann, Simonsen, 1989; Hoffmann, Dunham, 1995; Lang et al., 1998; Pedrson et al., 1999). Приводятся данные о том, что цито-халазин, вещество, вызывающее деполимеризацию филаментов актина, ингибирует развитие RVD в ряде типов дифференцированных клеток (Linshaw et al., 1992; Cornet et al., 1993).

На культурах клеток обнаружено, что оуабаин чувствительная Na+/K+-АТФаза также вовлекается в развитие RVD (Rosenberg et al., 1972; Buckhold et al., 1973). Полагают, что компенсаторный ответ на осмотический стресс не требует прямого участия активного транспорта и регулируется он только пассивным выходом электролитов (K+,

Cl-) или органических осмолитов (Hoffmann et al., 2009). Однако Na-K насос активизируется при уменьшении уровня цитоплазматического калия, основного осмотически активного иона, что в результате может модифицировать кинетику RVD. Возможно, активизация №+/К+-АТФа-зы опосредовано влияет на осмотический статус клетки через гидролиз АТФ.

Механизмы, управляющие RVD, изучали, используя изолированный ооцит и одноклеточный эмбрион мыши, как удобную экспериментальную модель (Van Winkle et al., 1994; Seguin, Baltz, 1997; Kolajova, Baltz, 1999). Однако кинетика осмотического ответа эмбриональной клетки на стадиях, последующих за первым клеточным циклом, оставалась не изученной (Collins, Baltz, 1999). До сих пор аналитические эксперименты в данном направлении ограничены отсутствие адекватного метода измерения объема отдельного бластомера.

При расчете объема клетки исходят из ряда предпосылок: наличие сферической формы, пространственная изотропность при изменении объ-

ема, известное математическое соотношение между линейным размером поперечного сечения и объемом клетки. Перечисленные предположения могут выполняться в случае одиночной клетки, например ооцита или зиготы, но не применимы для многоклеточной системы. Даже для такого простого объекта, как двухклеточный эмбрион, характерно отсутствие сферической симметрии. Однако сложное пространственное строение не препятствует измерению объема при использовании метода количественной LSM (Погорелова и др., 2008; 2009; Pogorelov, Pogorelo-va, 2008). Лазерная микротомографии с последующей 3D реконструкцией применительно к двух-клеточному эмбриону мыши позволила нам решить следующие задачи: (1) изучить кинетику изменения объема бластомера в гипотонических условиях, (2) оценить вклад цитоскелета и Ма+/К+-АТРазы в осмотический ответ эмбриональной клетки.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Исследования проводили на белых лабораторных мышах SHK из питомника ИТЭБ РАН. Двух-клеточные эмбрионы получали в соответствии с методикой, описанной ранее (Березовская и др., 1986; Манк, 1990). В качестве контрольного образца использовали эмбрионы, взятые непосредственно после выделения из яйцевода в среду Дюльбекко. Гипоосмотический шок моделировали изменением концентрации соли NaCl в среде, которая исходно содержит следующие компоненты: NaCl (140 мМ), KCl (2.7 мМ), MgCl2 • 6H2O (0.5 мМ), KH2PO4 (1.5 мМ), CaCl2 (0.9 мМ), Na2HPO4 • 12H2O (7.0 мМ), NaH2PO4 • 2H2O (1.3 мМ), глюкоза (0.2 мМ), pH = 7.4.

Принципы подготовки препарата для LSM описаны нами ранее (Pogorelov et al., 1991; 1994; Погорелов, Гольдштейн, 2006; Pogorelov et al., 2006). На начальном этапе объект фиксируется посредством сверхбыстрой заморозки в жидком пропане (85 К), что позволяет сохранить прижизненную форму эмбриона. Криофиксированные образцы подвергали низкотемпературной дегидратации в вакууме (~10-5 Pa) при температуре (173 К), используя установку MBA 5 (Balzers, Лихтенштейн). По завершении лиофилизации, высушенный объект заключали в заливочную среду, приготовленную на основе эпоксидной смолы Epon 812.

Измерение объема отдельного бластомера проводили посредством количественной LSM (Погорелова и др., 2008; 2009; Pogorelov, Pogorelo-va, 2008). После термополимеризации (330 К) за-

ливочной среды, стеклянным ножом затачивали поверхность полученного блока, который затем монтировали на предметное стекло. Подготовленный препарат изучали в конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510 Axioplan 2 imaging (Zeiss, Германия), используя HeNe 633 нм лазер (Zeiss, Германия). В режиме прошедшего света получали в вертикальном направлении стопку оптических срезов с шагом 1 мкм.

Учитывая низкий контраст эмбриона, заключенного в прозрачную заливочную среду, цифровое изображение каждого оптического среза обрабатывали по унифицированному алгоритму используя, например, программу Adobe Photoshop 7.0 или GIMP 2.2.17 http://gimp-win.sourceforge. net/. На микрофотографии эмбриона в плоскости каждого оптического среза обрисовывали контуры бластомеров и по серии последовательных контуров восстанавливали трехмерный вид эмбриональной клетки. Трехмерную реконструкцию проводили посредством стандартного графического редактора 3ds max http://www.discreet.com/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты количественной LSM двухклеточного эмбриона мыши, подверженного гипоосмотическому стрессу

Рисунок 1 иллюстрирует характерный вид двухклеточного эмбриона мыши, полученный посредством его 3 DR по серии последовательных оптических срезов.

Количественная LSM позволяет не только получить трехмерное изображение отдельной клетки, но и определить ее объем (рис. 1). В таблице 1 суммированы результаты измерения объемных характеристик бластомера в течение гипоосмоти-ческого стресса.

Видно (табл. 1), что в гипотонических условиях эмбриональная клетка в начале увеличивается, достигая максимального объема в районе 10 минут осмотического воздействия, а затем плавно возвращается к исходному состоянию. Компенсаторный ответ по типу RVD может быть индуцирован механической деформацией цитоскелета. В случае участия актиновых микрофиламентов в регуляции клеточного объема, деполимеризация полимерных цепей актина цитохалазином должна отменить RVD. Таблица 2 содержит сравнительные данные по кинетики реакции двухкле-точного эмбриона мыши на гипотонический стресс в среде, содержащей Cyto B.

В эксперименте с Cyto B (табл. 2) эмбрионы прединкубировали 15 минут в изотонической среде Дюльбекко, содержащей препарат. В первые

Рис. 1. Двухклеточный эмбрион мыши: (А) 3 ВЯ изображение эмбриона сразу после его выделения из яйцевода, (Б) микрофотография того же эмбриона в плоскости оптического среза, (В) 3 ВЯ изображение эмбрион после 15 минут осмотического стресса (190 мОсм) в среде Дюльбекко, содержащей 80 мМ соли КаС1, (Г) микрофотография того же эмбриона в плоскости оптического среза. Сокращения: Ь1 — бластомер, N — ядро, рЬ — полярное тельце, V — объем бластомера в пиколитрах (пл), 2р —зона пелюцида.

минуты наблюдали выраженные изменения в виде выростов на поверхности бластомера (рис. 2), с последующим восстановлением формы клетки.

ЯУО регулируется только пассивным транспортом осмолитов из клетки, в том числе иона ка-

лия основного клеточного электролита. Однако уменьшение уровня цитоплазматического К+ активизирует №+/К+-АТФазу, что в результате может модифицировать кинетику компенсаторного ответа. Таким образом, данные (табл. 3) экспери-

Рис. 2. Изображение двухклеточного эмбриона мыши после 5 минут предобработки в обычной среде Дюльбекко, содержащей цитохалазин Б (5 мкг/мл). (А) микрофотография эмбриона в плоскости оптического среза, (Б) тот же эмбрион после 3 В реконструкции. Сокращения: Ь1 — бластомер, Ь — складки, N — ядро, рЬ — полярное тельце; V — объем бластомера в пиколитрах (пл), р8 — перивителлиновое пространство, 2р — зона пелюцида.

Таблица 1. Изменение объема бластомера (пиколитры) двухклеточного эмбриона мыши в течение гипоосмоти-ческого стресса (мОсм), моделируемого изменением концентрации соли №С1 в среде Дюльбекко3

Концентрация NaCl в среде Длительность гипотонического стресса

0 минь 5 мин* 10 мин* 15 мин* 30 мин 45 мин 60 мин

60 мМ (150 мОсм) 59 ± 4 n = 24 90 ± 10 n = 24 106 ± 7 n = 21 102 ± 9 n = 24 80 ± 12* n = 22 65 ± 9* n = 20 60 ± 7 n = 22

70 мМ (170 мОсм)

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком