ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2012, № 1, с. 72-77
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.115.3:612.115.064
КОМПЛЕКС ГЕПАРИНА С ПЕПТИДОМ Arg-Pro-Gly-Pro И ЕГО АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИЕ И ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ
© 2012 г. Л. А. Ляпина*, Н. Ф. Мясоедов**, Л. А. Андреева**, Т. Ю. Оберган*, Т. А. Шубина*, М. Е. Григорьева*, В. Е. Пасторова*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, каф. физиологии человека и
животных, 119992 Москва, Ленинские горы, 1, корп. 12 **Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. акад. Курчатова, 2 E-mail: lyapinal@mail.ru Поступила в редакцию 02.03.2011 г.
Исследовано комплексное соединение гепарина с аргининсодержащим пептидом Arg-Pro-Gly-Pro при молярном соотношении пептида и гепарина 1 : 1. Полученный комплекс обладал антитромбо-цитарной, антикоагулянтной и фибриндеполимеризационной активностями. In vivo на фоне развития диабета 2-го типа пятикратное интраназальное введение комплекса приводило к восстановлению нарушенных функций как инсулярной, так и противосвертывающей систем организма. При этом в крови животных возрастали активности фибринолитической и антикоагулянтной систем.
Ранее установлено, что регуляторные пролин-содержащие пептиды — глипролины с последовательностью аминокислот Рго-С1у, Рго-С1у-Рго, С1у-Рго, препятствуют развитию сахарного диабета и процессов тромбообразования при их экспериментальной провокации (Ляпина и др., 2006; Ашмарин и др., 2008). Показано, что глипролины с включенным с С-конца молекулы аргинином понижают уровень сахара крови (Ульянов и др., 2009). Аргинин является предшественником оксида азота (N0), который образуется в ходе окислительной реакции, катализируемой группой ферментов, N0-синтаз, в присутствии кофакторов, образующих в совокупности Ь-аргинин— N0-систему. По механизму отрицательной обратной связи происходит регуляция N0-синтазы. N0 участвует в регуляции ряда физиологических реакций — вазодилатации, нейротрансмиссии, снижения агрегации тромбоцитов, регуляции тонуса гладких мышц и др. (№роИ г1 а1, 2007). Поэтому в присутствии аргинина в кровотоке наблюдается ингибирование свертывания крови и улучшение ее реологических свойств, активация фибринолиза, повышение антитромбоцитарной активности и нормализация уровня сахара крови (Баркаган, Костюченко, 2006; Симонян и др., 2007; Вгишш г1 а1, 2007), нейтрализация свободных радикалов (МсСопе11, 2007). Благодаря указанным свойствам, аргинин снижает риск развития заболеваний сердечно-сосудистой системы, атеросклероза, сахарного диабета (МсСопе11, 2007). Применение Ь-аргинина при диабете 2-го типа значительно повышает чувствительность к
инсулину периферических рецепторов, а также рецепторов печени (Piatti et al., 2001; Lu et al., 2006; Mendez, Balderas, 2006). Установлено, что развитие диабета сопровождается подавлением функции противосвертывающей системы и повышением степени агрегации тромбоцитов (Пасторова и др., 2003), снижением активности антикоагулянтной и фибринолитической систем (Ашмарин и др., 2008; Шубина и др., 2008).
Один из природных антикоагулянтов системы гемостаза — гепарин, блокирует свертывающую активность тромбина (Aster, 2006) и, одновременно, проявляет в организме гиполипидемическое, гипогликемическое и противовоспалительное действие. Экспериментальные данные, подтвержденные затем в клинических условиях, свидетельствуют об усилении противосвертывающих и антидиабетогенных свойств гепарина при образовании комплексных соединений с некоторыми низкомолекулярными веществами (Kudrjashov, Lyapina, 1986). Так, комплексное соединение аргинина с гепарином (Ляпина и др., 2009; Ульянов и др., 2010), а также ряд пептидов глипролинового ряда с включенными с N-конца пептида аминокислотами аргинином или лейцином — Pro-Gly-Arg, Pro-Gly-Pro-Arg, Pro-Gly-Pro-Leu (Ульянов и др., 2009; Ляпина и др., 2010), активируют анти-коагулянтно-фибринолитическое звено противо-свертывающей системы и защищают организм крыс от развития сахарного диабета.
Цель работы — получение комплексного соединения гепарина с глипролином, включающим
аргинин с N-конца молекулы — Arg-Pro-Gly-Pro (ArgPGP), и изучение его противосвертывающей и антидиабетогенной активностей при экспериментальном развитии сахарного диабета 2-го типа и сопутствующем ему подавлении противо-свертывающей системы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали высокомолекулярный гепарин (Serva, Германия), пептид ArgPGP, синтезированный в Институте молекулярной генетики РАН. Комплекс пептида с гепарином при молярном соотношении составных частей 1 : 1 получали модифицированным нами методом (Ульянов и др., 2010). Комплексообразование между гепарином и пептидом контролировали методом перекрестного электрофореза (Nakamura et al., 1960). Через 18 ч после проведения электрофореза производили окраску электрофореграмм с образцами пептида и гепарина на гепарин 0.033%-ным Азу-ром и на аминогруппы пептида 0.1%-ным нин-гидрином.
В условиях in vitro исследовали суммарную (СФА) и неферментативную (НФ) фибринолити-ческую (фибриндеполимеризационную) активности (Kudrjashov, Lyapina, 1986) полученного комплекса, для чего готовили растворы комплекса в пределах концентраций от 10-7 до 10-1 мг/мл и наносили на нестабилизированные фактором XIIIa фибриновые пленки в объеме 0.05 мл. Зоны лизиса измеряли спустя 2 ч после инкубации фибриновых пленок с комплексом при 37°С.
Эксперименты были проведены на 68 беспородных белых лабораторных крысах-самцах в возрасте 7 мес. с массой тела 270—350 г, содержащихся на естественном лабораторном рационе. Сахарный диабет 2-го типа у животных вызывали семикратным внутрижелудочным введением 40%-ного раствора глюкозы в объеме 0.5 мл на 200 г массы тела и одновременным внутримышечным введением 10%-ного раствора протаминсульфата (PS) в дозе 2 мг (0.2 мл) на 200 г массы тела в течение 7 сут. Через 1 ч после 7 сут введения глюкозы + + PS брали кровь на исследования параметров системы гемостаза и животных делили на две группы. Не прекращая введения глюкозы и PS, первой (опытной) группе крыс пятикратно (первые 2 сут 2 раза в сутки, на 3-и сут — 1 раз) вводили интраназально 0.4%-ный раствор комплекса гепарина с пептидом АrgPGP (из расчета 200 мкг (0.05 мл) на 200 г массы тела), второй (контрольной) группе крыс вместо комплекса в эти же сроки и в таком же объеме вводили 0.85%-ный раствор NaCl. Кровь для исследования брали через 1 ч после последнего введения комплекса или физиологического раствора. В дальнейшем как опытным, так и контрольным животным продолжали вводить через каждые 24 ч в течение 6 сут глюкозу + PS
при отмене введения комплекса гепарина с ArgPGP или NaCl. Кровь для дальнейших исследований брали через 1 ч после последнего введения глюкозы + PS. Итак, забор крови производили трижды: через 1 ч после 7 сут введения глюкозы + PS, через 1 ч после пятикратного применения комплекса или NaCl при продолжающемся введении глюкозы + PS, через 6 сут после отмены введения комплекса или NaCl при продолжающемся введении глюкозы + PS. При этом в каждом эксперименте одновременно осуществляли забор крови у здоровых крыс, содержавшихся на обычном лабораторном рационе (обозначено "норма"). Кровь в объеме 2 мл забирали из vena jugularis, в качестве консерванта использовали 3.8%-ный раствор лимоннокислого натрия в соотношении кровь : консервант 9 : 1. Определяли следующие биохимические параметры плазмы крови: СФА и НФ (Kudrjashov, Lyapina, 1986), активность тканевого активатора плазминогена (ТАП) (Баркаган, Ма-мот, 2001), Хагеман(XПa)-зависимый фибрино-лиз (ХЗФ) с использованием тест-набора (НПО Ренам, Россия), общую фибринолитическую активность по времени лизиса эуглобулиновой фракции плазмы (ОФА), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) (Долгов, Свирин, 2005). В плазме крови, обогащенной тромбоцитами, определяли агрегацию тромбоцитов (Бер-ковский и др., 2003) с 2—5 мкМ аденозиндифосфа-том (АДФ) в качестве агреганта; измерение проводили на агрегометре (производство МГУ, Россия). Концентрацию сахара крови измеряли на анализаторе Accutrend GC (Roche, Германия) с помощью тест-полосок для количественного определения сахара (Roche). Пробы крови центрифугировали в разных режимах: для определения агрегации тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме при 1000 g в течение 5 мин, а для проведения коагулологических тестов получали бедную тромбоцитами плазму при 3000 g в течение 10—12 мин.
Все данные были обработаны статистически по методу Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом перекрестного электрофореза доказали существование взаимодействия между аминогруппами аргинина в пептиде Arg-Pro-Gly-Pro и кислыми группами гепарина, так как при перпендикулярном нанесении двух компонентов происходило их передвижение в электрическом поле, и в месте встречи этих компонентов наблюдали отсутствие окраски на гепарин (0.033%-ным раствором Азура) или на аминогруппы (0.1%-ным нингидрином). В условиях in vitro комплекс в широком диапазоне концентраций от 10-7 до 10-1 мг/мл обнаруживал СФА, обусловленную НФ, так как зоны лизиса в обоих случаях были одинаковы и
Таблица 1. Показатели гемостаза после пятикратного интраназального введения крысам комплекса гепарин— А^РОР (М ± т)
Показатель гемостаза Контроль (0.85%-ный NaCl + глюкоза + PS ) Опыт (комплекс гепарин—ArgPGP + глюкоза + PS) Норма
СФА, мм2 30.3 ± 1.6# 42.8 ± 2.1** 38 ± 1.9
НФ, мм2 22.1 ± 1.1 28.8 ± 1.6** 24.6 ± 1
ТАП, мм2 13.3 ± 1.9## 30.3 ± 3.5** 28.3 ± 2.7
Агрегация тромбоцитов, 12.5 ± 3.4 (100%) 7.3 ± 2 (60%)* —
индекс(%)
АЧТВ, с 29.4 ± 1.8# 40.8 ± 1.9** 33.8 ± 0.69
ОФА, мм2 38.8 ± 3.4## 71.1 ± 4.9** 79 ± 5.4
ХЗФ, мин 8.5 ± 2.4 9.5 ± 1.9# 4.9 ± 0.3
Примечание. СФА — суммарная фибринолитическая активность, НФ — неферментативная фибринолитическая активность, ТАП — активность тканевого активатора плазминогена, АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время, ОФА — общая фибринолитическая активность, ХЗФ — Хагеман(ХПа)-зависимый фибринолиз, PS — протаминсульфат, "—" — нет данных. Статистические показатели рассчитаны относительно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.