КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ КИССПЕПТИНА
Горбунова О. Л., Ширшев С. В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Исследовано влияние недавно открытого гормона кисспептина, который детектируется в периферической крови только в период беременности, на фагоцитарную активность ней-трофилов, уровень CD16+ NK клеток и адаптивных Т-регуляторных лимфоцитов (аТ^), а также активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) мононуклеаров. Показано, что кисспептин в концентрациях, соответствующих I—III триместрам беременности, снижает фагоцитарную активность нейтрофилов и дозозависимо повышает количество аТ^. Кроме того, гормон в концентрации, соответствующей II триместру беременности усиливает ЛПС-индуцируемую активность IDO моноцитов. Угнетение кисспептином количества CD16+NK клеток возможно только в концентрациях, экстраполированных со II и III триместра беременности.
Ключевые слова: кисспептин, моноциты, нейтрофилы, фагоцитоз, NK-клетки, Treg
Введение. Гормоны являются важными модуляторами функциональной активности клеток иммунной системы. Особенно это актуально для гормонов, продуцируемых плацентой [1]. Недавно открытый гормон кисспептин, который регулирует функционирование гонадо-стата на гипоталамическом уровне [2], во время беременности продуцируется плацентой и, благодаря этому, появляется в системном кровообращении матери [1]. Беременность представляет собой феномен естественной полуаллогенной трансплантации, поэтому исследование механизмов формирования имму-ной толерантности матери к плоду представляют собой актуальную проблему и вызывает все больший интерес. Иммуномодулирующее действие кисспептина только начинает изучаться [3], но уже установлено, что клетки иммунной системы экспрессируют для него специфические мембранные рецепторы [4].
Цель работы - оценить влияние кисспепти-на на фагоцитарную активность нейтрофилов, уровень натуральных киллеров (NK-клетки), адаптивных Т-регуляторных лимфоцитов (аТге§), а также активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) моноцитов.
Материал и методы. Объектом изучения являлись сепарированные нейтрофилы и мо-нонуклеары периферической крови (МПК) небеременных женщин репродуктивного
возраста, выделенные на двойном градиенте плотности фиколл-верографина. Плотности верхнего и нижнего градиентов составили 1,077 и 1,112 г/мл, соответственно. Кисспептин (Metastin, Synthetic, CALBIOCHEM, США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови в I, II и III триместрах беременности, - 1,3 пМ/л, 4,6 пМ/л и 9,6 пМ/л, соответственно [1]. В контрольные пробы добавляли официнальный растворитель.
Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по поглощению бактерий люминесцентного генно-инженерного штамма E.coli lux+ [5], которые несут lux-оперон морской люминесцентной бактерии V fischeri («Эколюм-5») и обладают способностью к биолюминесценции, снижающейся процессе фагоцитоза прямо пропорционально их количеству в реакционной смеси. Суспензию бактерий (180 мкл, 5х106 /мл) вносили в лунки 96-луночного планшета, инкубировали при 37°C в течение 3-5 мин и снимали фоновый уровень свечения бактерий, затем вносили обогащенную нейтрофилами клеточную культуру с 10% аутоплазмой, и измеряли степень гашения биолюминесценции в течение 30 мин, регистрируя показатели каждые 10 мин. Для выражения результатов рассчитывали индекс фагоцитарной активности (ИФА), отражаю-
Тематический выпуск «Российский научный форум на Урале»
289
щий процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем. ИФА=100х (Х1-Х2) /Х1, где Х1-интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), Х2 - опытной пробы (бактерии + фагоциты) [5]. Измерение производилось на многофункциональном фотометре Synergy H1 («Bio-Tek Instrumens, Inc.», США).
Для оценки фенотипа МПК (5-106/мл/кле-ток) культивировали с кисспептином в полной питательной среде (RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 200 ед/мл ген-тамицина) в течение 24 ч при 37°С в условиях 5% СО2 с гормоном. После этого на проточном цитофлуориметре («Becton Dickinson», США) с использованием стандартной процедуры поверхностного и внутриклеточного окрашивания моноклональными антителами («eBioscience», США) в гейте лимфоцитов оценивали уровень NK-клеток (anti-human CD3-FITC; anti-human CD16,56-PE) и Treg клеток (anti-human CD4-FITC; anti-human Foxp3-PE).
Активность IDO в МПК определяли спек-трофотометрически по изменению концентрации кинуренина - первого стабильного метаболита lDO-реакции [6], используя стандартный индуктор - липополисахарид (ЛПС) 100 нг/мл («Sigma», США) [7]. МПК, стимулированные ЛПС, культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкМ триптофана («Sigma», США), в течение 4 часов. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин. после чего в лунки 96-луночного планше-
та вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Synerge H1 («Bio-Tek Instrumens, Inc.», США).
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Как видно из табл., часовая инкубация с кисспептином в концентрации, соответствующей I триместру беременности, снижает фагоцитарную активность нейтрофилов в динамике всего исследования, а в концентрациях, соответствующих II и III триместру,- начиная с 20 мин. исследования. Установлено, что суточная инкубация клеточных культур с кисспептином в концентрациях, соответствующих II и III триместру беременности снижает процент CD3CD16+CD56+ клеток. Ранее выявлено, что у женщин со спонтанными абортами наблюдается снижение трофобластом выработки кисспептина, что напрямую коррелирует с повышением количества данных клеток в крови и децидуальной оболочке [8]. Таким образом, полученные нами данные, позволяют рассматривать кисспептин в качестве наиболее вероятного регулятора функциональной активности NK клеток во время беременности.
При оценке ЛПС-индуцируемой активности IDO в МПК установлено, что кисспептин достоверно усиливает активность фермента только в концентрации, соответствующей II триместру беременности (Кинуренин, мкМ: контроль - 3,64±0,39; ЛПС - 4,77±0,53, p>0,05; кисспептин 1,3 пМ/л+ЛПС - 5,51±0,99, p>0,05;
Таблица. Влияние кисспептина на фагоцитарную активность нейтрофилов, уровень NK- (CD3CD16+CD56+) и аTreg (CD4+FOXP3+) лимфоцитов
Экспериментальное Воздействие Контроль Кисспептин 1,3 пмоль/л Кисспептин 4,6 пмоль/л Кисспептин 9,6 пмоль/л
ИФА, 10 мин. 47,27 ± 1,24 38,62 ± 1,66* 49,59 ± 2,25 50,74 ± 3,23
ИФА, 15 мин. 58,11 ± 1,79 43,48 ± 2,72* 56,18 ± 0,69 57,02 ± 0,71
ИФА, 20 мин. 62,02 ± 1,21 41,62 ± 2,32* 55,89 ± 1,80* 56,25 ± 1,96*
ИФА, 25 мин. 78,71 ± 1,77 51,52 ± 3,19* 66,73 ± 1,66* 66,31 ± 1,40*
ИФА, 30 мин. 80,14 ± 2,04 52,84 ± 1,55* 65,38 ± 1,89* 66,39 ± 2,21*
С03С016+С056+, (%) 11,32 ± 0,81 11,34 ± 0,95 9,68 ± 1,05* 9,79 ± 0,52*
С04ТОХР3+, (%) 0,53 ± 0,05 0,65 ± 0,06* 0,73 ± 0,07*,# 0,96 ± 0,10*,#,Л
Примечание: "достоверные (р<0,05) по парному ^критерию Стьюдента по отношению к контролю; #достоверные (р<0,05) по парному ^критерию Стьюдента по отношению к концентрации кисспептина 1,3 пмоль/л; Достоверные (р<0,05) по парному ^критерию Стьюдента по отношению к концентрации кисспептина 4,6 пмоль/л
кисспептин 4,6 пМ/л+ЛПС -7,20±0,77, р<0,05; кисспептин 9,6 пМ/л+ЛПС-5,99±1,70, p>0,05). Учитывая, что IDO продуцируется только антигенпрезентирующими клетками, которые в МПК представлены моноцитами, можно предполагать, что кисспептин усиливает ЛПС-стимулирующий сигнал, приводящий к экспрессии активного IDO в данных клетках.
Оценка влияния кисспептина на процессы индукции адаптивных (а) Treg показала, что гормон дозозависимо повышает процент CD4+FOXP3+ клеток, уровень которых определяет доминантную толерантность при беременности [9]. Важно подчеркнуть, что действие кисспептина дозозависимо и достоверно нарастает в динамике беременности (табл.).
Таким образом, комплексное исследование иммуномодулирующей активности кисспеп-тина показало, что гормон вне зависимости от концентрации угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов. На протяжении всей беременности кисспептин усиливает генерацию aTreg. Во II и III триместрах беременности гормон дополнительно снижает количество цитотоксических CD16+ NK-клеток и, возможно, участвует в снижении численности данной субпопуляции при беременности. Кроме того, во II триместре беременности, наиболее опасном в плане развития абортов иммунного генеза, у кисспептина появляется
способность усиливать индукцию IDO моноцитами, что, как правило, приводит к гибели цитотоксических Т-лимфоцитов [9] и дополнительно способствуют генерации aTreg [10].
Работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-01102А «Роль кисспептина в регуляции формирования и функциональной активности Т-регуляторных клеток и T-хелперов 17 (Th17) во время беременности».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Horikoshi Y., Matsumoto H., Takatsu Y. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 2, 914-919.
2. Dhillo W. S., Murphy K. G., Bloom S. R. Rev. Endocrinol. Metab. Disord. 2007, 8, 41-46.
3. Горбунова О. Л., Ширшев С. В., Заморина С. А. Иммунология 2013, 5, 247-251.
4. Muir A. I., Chamberlain L., Elshourbagy N. A. et al. J. Biol. Chem. 2001, 276, 28969-28975.
5. Ширшев С. В., Куклина Е. М., Заморина С. А. и др. Патент РФ. № 2292553, 2007.
6. Fallarino F., Grohmann U., Hwang K. W. et al. Nat. Immunol. 2003, 4, 1206-1212.
7. Braun D., Longman R. S., Albert M. L. Blood. 2005, 106,2375-2381.
8. Park D. W., Lee S. K., Hong S. R. et al. Am J Reprod Immunol. 2012, 67, 132-139.
9. Ширшев С. В. Иммунология материнско-фе-тальных взаимодействий. Екатеринбург: УрО РАН 2009, 582 с.
10. Schumacher A., Brachwitz N., Sindy S. et al. J. Immunol. 2009, 182, 5488-5497.
INTEGRATED STUDY IMMUNOMODULATORY ACTIVITY
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.