научная статья по теме КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ КИССПЕПТИНА Биология

Текст научной статьи на тему «КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ КИССПЕПТИНА»

КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ КИССПЕПТИНА

Горбунова О. Л., Ширшев С. В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Исследовано влияние недавно открытого гормона кисспептина, который детектируется в периферической крови только в период беременности, на фагоцитарную активность ней-трофилов, уровень CD16+ NK клеток и адаптивных Т-регуляторных лимфоцитов (аТ^), а также активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) мононуклеаров. Показано, что кисспептин в концентрациях, соответствующих I—III триместрам беременности, снижает фагоцитарную активность нейтрофилов и дозозависимо повышает количество аТ^. Кроме того, гормон в концентрации, соответствующей II триместру беременности усиливает ЛПС-индуцируемую активность IDO моноцитов. Угнетение кисспептином количества CD16+NK клеток возможно только в концентрациях, экстраполированных со II и III триместра беременности.

Ключевые слова: кисспептин, моноциты, нейтрофилы, фагоцитоз, NK-клетки, Treg

Введение. Гормоны являются важными модуляторами функциональной активности клеток иммунной системы. Особенно это актуально для гормонов, продуцируемых плацентой [1]. Недавно открытый гормон кисспептин, который регулирует функционирование гонадо-стата на гипоталамическом уровне [2], во время беременности продуцируется плацентой и, благодаря этому, появляется в системном кровообращении матери [1]. Беременность представляет собой феномен естественной полуаллогенной трансплантации, поэтому исследование механизмов формирования имму-ной толерантности матери к плоду представляют собой актуальную проблему и вызывает все больший интерес. Иммуномодулирующее действие кисспептина только начинает изучаться [3], но уже установлено, что клетки иммунной системы экспрессируют для него специфические мембранные рецепторы [4].

Цель работы - оценить влияние кисспепти-на на фагоцитарную активность нейтрофилов, уровень натуральных киллеров (NK-клетки), адаптивных Т-регуляторных лимфоцитов (аТге§), а также активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) моноцитов.

Материал и методы. Объектом изучения являлись сепарированные нейтрофилы и мо-нонуклеары периферической крови (МПК) небеременных женщин репродуктивного

возраста, выделенные на двойном градиенте плотности фиколл-верографина. Плотности верхнего и нижнего градиентов составили 1,077 и 1,112 г/мл, соответственно. Кисспептин (Metastin, Synthetic, CALBIOCHEM, США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови в I, II и III триместрах беременности, - 1,3 пМ/л, 4,6 пМ/л и 9,6 пМ/л, соответственно [1]. В контрольные пробы добавляли официнальный растворитель.

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по поглощению бактерий люминесцентного генно-инженерного штамма E.coli lux+ [5], которые несут lux-оперон морской люминесцентной бактерии V fischeri («Эколюм-5») и обладают способностью к биолюминесценции, снижающейся процессе фагоцитоза прямо пропорционально их количеству в реакционной смеси. Суспензию бактерий (180 мкл, 5х106 /мл) вносили в лунки 96-луночного планшета, инкубировали при 37°C в течение 3-5 мин и снимали фоновый уровень свечения бактерий, затем вносили обогащенную нейтрофилами клеточную культуру с 10% аутоплазмой, и измеряли степень гашения биолюминесценции в течение 30 мин, регистрируя показатели каждые 10 мин. Для выражения результатов рассчитывали индекс фагоцитарной активности (ИФА), отражаю-

Тематический выпуск «Российский научный форум на Урале»

289

щий процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем. ИФА=100х (Х1-Х2) /Х1, где Х1-интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), Х2 - опытной пробы (бактерии + фагоциты) [5]. Измерение производилось на многофункциональном фотометре Synergy H1 («Bio-Tek Instrumens, Inc.», США).

Для оценки фенотипа МПК (5-106/мл/кле-ток) культивировали с кисспептином в полной питательной среде (RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 200 ед/мл ген-тамицина) в течение 24 ч при 37°С в условиях 5% СО2 с гормоном. После этого на проточном цитофлуориметре («Becton Dickinson», США) с использованием стандартной процедуры поверхностного и внутриклеточного окрашивания моноклональными антителами («eBioscience», США) в гейте лимфоцитов оценивали уровень NK-клеток (anti-human CD3-FITC; anti-human CD16,56-PE) и Treg клеток (anti-human CD4-FITC; anti-human Foxp3-PE).

Активность IDO в МПК определяли спек-трофотометрически по изменению концентрации кинуренина - первого стабильного метаболита lDO-реакции [6], используя стандартный индуктор - липополисахарид (ЛПС) 100 нг/мл («Sigma», США) [7]. МПК, стимулированные ЛПС, культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкМ триптофана («Sigma», США), в течение 4 часов. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин. после чего в лунки 96-луночного планше-

та вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Synerge H1 («Bio-Tek Instrumens, Inc.», США).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Как видно из табл., часовая инкубация с кисспептином в концентрации, соответствующей I триместру беременности, снижает фагоцитарную активность нейтрофилов в динамике всего исследования, а в концентрациях, соответствующих II и III триместру,- начиная с 20 мин. исследования. Установлено, что суточная инкубация клеточных культур с кисспептином в концентрациях, соответствующих II и III триместру беременности снижает процент CD3CD16+CD56+ клеток. Ранее выявлено, что у женщин со спонтанными абортами наблюдается снижение трофобластом выработки кисспептина, что напрямую коррелирует с повышением количества данных клеток в крови и децидуальной оболочке [8]. Таким образом, полученные нами данные, позволяют рассматривать кисспептин в качестве наиболее вероятного регулятора функциональной активности NK клеток во время беременности.

При оценке ЛПС-индуцируемой активности IDO в МПК установлено, что кисспептин достоверно усиливает активность фермента только в концентрации, соответствующей II триместру беременности (Кинуренин, мкМ: контроль - 3,64±0,39; ЛПС - 4,77±0,53, p>0,05; кисспептин 1,3 пМ/л+ЛПС - 5,51±0,99, p>0,05;

Таблица. Влияние кисспептина на фагоцитарную активность нейтрофилов, уровень NK- (CD3CD16+CD56+) и аTreg (CD4+FOXP3+) лимфоцитов

Экспериментальное Воздействие Контроль Кисспептин 1,3 пмоль/л Кисспептин 4,6 пмоль/л Кисспептин 9,6 пмоль/л

ИФА, 10 мин. 47,27 ± 1,24 38,62 ± 1,66* 49,59 ± 2,25 50,74 ± 3,23

ИФА, 15 мин. 58,11 ± 1,79 43,48 ± 2,72* 56,18 ± 0,69 57,02 ± 0,71

ИФА, 20 мин. 62,02 ± 1,21 41,62 ± 2,32* 55,89 ± 1,80* 56,25 ± 1,96*

ИФА, 25 мин. 78,71 ± 1,77 51,52 ± 3,19* 66,73 ± 1,66* 66,31 ± 1,40*

ИФА, 30 мин. 80,14 ± 2,04 52,84 ± 1,55* 65,38 ± 1,89* 66,39 ± 2,21*

С03С016+С056+, (%) 11,32 ± 0,81 11,34 ± 0,95 9,68 ± 1,05* 9,79 ± 0,52*

С04ТОХР3+, (%) 0,53 ± 0,05 0,65 ± 0,06* 0,73 ± 0,07*,# 0,96 ± 0,10*,#,Л

Примечание: "достоверные (р<0,05) по парному ^критерию Стьюдента по отношению к контролю; #достоверные (р<0,05) по парному ^критерию Стьюдента по отношению к концентрации кисспептина 1,3 пмоль/л; Достоверные (р<0,05) по парному ^критерию Стьюдента по отношению к концентрации кисспептина 4,6 пмоль/л

кисспептин 4,6 пМ/л+ЛПС -7,20±0,77, р<0,05; кисспептин 9,6 пМ/л+ЛПС-5,99±1,70, p>0,05). Учитывая, что IDO продуцируется только антигенпрезентирующими клетками, которые в МПК представлены моноцитами, можно предполагать, что кисспептин усиливает ЛПС-стимулирующий сигнал, приводящий к экспрессии активного IDO в данных клетках.

Оценка влияния кисспептина на процессы индукции адаптивных (а) Treg показала, что гормон дозозависимо повышает процент CD4+FOXP3+ клеток, уровень которых определяет доминантную толерантность при беременности [9]. Важно подчеркнуть, что действие кисспептина дозозависимо и достоверно нарастает в динамике беременности (табл.).

Таким образом, комплексное исследование иммуномодулирующей активности кисспеп-тина показало, что гормон вне зависимости от концентрации угнетает фагоцитарную активность нейтрофилов. На протяжении всей беременности кисспептин усиливает генерацию aTreg. Во II и III триместрах беременности гормон дополнительно снижает количество цитотоксических CD16+ NK-клеток и, возможно, участвует в снижении численности данной субпопуляции при беременности. Кроме того, во II триместре беременности, наиболее опасном в плане развития абортов иммунного генеза, у кисспептина появляется

способность усиливать индукцию IDO моноцитами, что, как правило, приводит к гибели цитотоксических Т-лимфоцитов [9] и дополнительно способствуют генерации aTreg [10].

Работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-01102А «Роль кисспептина в регуляции формирования и функциональной активности Т-регуляторных клеток и T-хелперов 17 (Th17) во время беременности».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Horikoshi Y., Matsumoto H., Takatsu Y. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 2, 914-919.

2. Dhillo W. S., Murphy K. G., Bloom S. R. Rev. Endocrinol. Metab. Disord. 2007, 8, 41-46.

3. Горбунова О. Л., Ширшев С. В., Заморина С. А. Иммунология 2013, 5, 247-251.

4. Muir A. I., Chamberlain L., Elshourbagy N. A. et al. J. Biol. Chem. 2001, 276, 28969-28975.

5. Ширшев С. В., Куклина Е. М., Заморина С. А. и др. Патент РФ. № 2292553, 2007.

6. Fallarino F., Grohmann U., Hwang K. W. et al. Nat. Immunol. 2003, 4, 1206-1212.

7. Braun D., Longman R. S., Albert M. L. Blood. 2005, 106,2375-2381.

8. Park D. W., Lee S. K., Hong S. R. et al. Am J Reprod Immunol. 2012, 67, 132-139.

9. Ширшев С. В. Иммунология материнско-фе-тальных взаимодействий. Екатеринбург: УрО РАН 2009, 582 с.

10. Schumacher A., Brachwitz N., Sindy S. et al. J. Immunol. 2009, 182, 5488-5497.

INTEGRATED STUDY IMMUNOMODULATORY ACTIVITY

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»