ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 1, с. 13-19
УДК 581.1
КОМПЛЕКСЫ ФС II С ДЕСТАБИЛИЗИРОВАННЫМ ПЕРВИЧНЫМ ХИНОННЫМ АКЦЕПТОРОМ ЭЛЕКТРОНОВ У АДАПТИРОВАННОЙ К ТЕМНОТЕ Chlorella
© 2004 г. Ю. К. Чемерис, Н. С. Корольков, Н. X. Сейфуллина, Ä. Б. Рубин
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва
Поступила в редакцию 27.02.2003 г.
Инкубация в течение 24 ч в темноте (при 37°С) водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick не приводила к изменению начального (F0) и максимального (Fm) выхода флуоресценции хлорофилла у обработанных диуроном клеток. У инкубированной в темноте водоросли в 2 раза возрастал вклад медленной (время нарастания 10-15 мин) фазы в кинетике нарастания Fm и, соответственно, переменной флуоресценции Fv (где F v = Fm - F0). Также, для достижения Fm требовались более высокие концентрации диурона, ингибирующего перенос электронов между первичным (QA) и вторичным (QB) хи-нонными акцепторами электронов в ФС II. Ингибирование фотосинтетического транспорта электронов (о-)фенантролином, способным в высоких концентрациях конкурентно вытеснять как QB, так и Qa, приводило к уменьшению выхода Fm за счет избирательного подавления медленной фазы нарастания. Предполагается, что медленная фаза в кинетике нарастания Fm отражает функционирование комплексов ФС II с дестабилизированным первичным хиноном. Такая дестабилизация QA может быть результатом модификации основных белков ФС II (D1 и D2) у адаптированной к темноте Chlorella.
Chlorella pyrenoidosa - переменная флуоресценция - QA - (о-)фенантролин
Как известно [1], у кислород-выделяющих фо-тосинтезирующих организмов увеличение выхода флуоресценции хлорофилла обусловлено переходом реакционных центров (РЦ) ФС II в "закрытое" состояние, при котором они не способны к фотохимическому тушению энергии возбуждения, поступающей из светособирающей антенны. У нативных организмов накопление РЦ ФС II, находящихся в "закрытом" состоянии, т.е. с восстановленным первичным хинонным акцептором - QA, зависит от целого ряда процессов, определяющих эффективность окислительно-восстановительных превращений QA в фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Именно с этим обстоятельством связана сложная форма индукционной кривой флуоресценции с наличием ряда промежуточных максимумов и плато [2, 3]. Измерение индукционных кривых флуоресценции хлоро-
Сокращения: Fo и Рт - соответственно начальный и максимальный выходы флуоресценции хлорофилла; Fv - переменная флуоресценция хлорофилла, мFv. и бFv медленная и быстрая фазы в кинетике нарастания РЦ - реакционные центры; QA и Qв - первичный и вторичный хинонные акцепторы электронов.
Адрес для корреспонденции: Чемерис Юрий Константинович. 119899 Москва, Московский государственный университет, биологический факультет, кафедра биофизики. Факс: 07(095)939-11-15; электронная почта: chemeris@biophys.msu.ru
филла в присутствии диурона в значительной степени упрощает ситуацию, поскольку диурон инги-бирует окисление восстановленного QA в дальнейшем переносе электрона на пластохинон. В этом случае освещение клеток высших растений или водорослей, обработанных диуроном, приводит к увеличению выхода флуоресценции хлорофилла от начального - F0 до максимального - Ет уровня. Соответствующая кинетика переменной флуоресценции - Fv (где Fv = Ет - ^0), отражающая накопление РЦ ФС II с восстановленным QA, характеризуется наличием медленной и быстрой фаз нарастания флуоресценции [2]. Две кинетически различные фазы в индукционной кривой нарастания флуоресценции в присутствиии диурона указывают на функционирование двух различных фракций хлорофилл-белковых комплексов ФС II, отличающихся по скорости формирования бА [4].
Ранее мы обнаружили [5], что длительное (1220 ч) выдерживание в темноте при 37°С предварительно выращенной на свету культуры хлореллы вызывало значительное (более чем в 2 раза) увеличение вклада медленной фазы (со временем нарастания несколько минут) в кинетике нарастания переменной флуоресценции у обработанных диуроном клеток водоросли. Ясно, что увеличение вклада медленной фазы при темновой инку-
бации клеток может указывать на переход большей части хлорофилл-белковых комплексов ФС II в состояние с низкой эффективностью восстановления QA из-за снижения активности фотохимических реакций.
Такое снижение фотохимической активности может быть результатом инактивации кислород-выделяющей системы, так как было показано [6], что темновая инкубация водоросли приводит к выходу ионов марганца из центров их связывания на донорной стороне ФС II.
С другой стороны, при исследовании синхронной культуры Scenedesnus [7] была обнаружена потеря чувствительности к диурону у 30% РЦ ФС II во время темнового периода последовательных циклов синхронизации. Потерю чувствительности к диурону при темновой инкубации клеток связывают [7] с модификацией основных белков РЦ ФС II, приводящей к уменьшению сродства диу-рона к Dl-белку. Вполне вероятно, что модификация белков РЦ ФС II может также приводить и к дестабилизации первичного хинона на D2-бел-ке. Очевидно, что у комплексов ФС II с дестабилизированным Qa переход в состояние с QA будет происходить гораздо медленнее, чем у комплексов ФС II с нормально связанным QA.
Известно [8, 9], что (о-)фенантролин, так же как и диурон, ингибирует фотосинтетический транспорт электронов в результате конкурентного вытеснения вторичного хинонного акцептора-Qß с места его посадки на Dl-белке, что само по себе уже делает невозможным окисление восстановленного Qa. Предполагается [10, 11], что в высоких концентрациях (о-)фенантролин способен вытеснять не только вторичный, но и первичный хи-нонный акцептор QA с места его посадки на D2-белке хлорофилл-белкового комплекса ФС II, что делает невозможным и восстановление QA. Если медленная фаза нарастания переменной флуоресценции у адаптированной к темноте хлореллы действительно отражает накопление QA комплексами ФС II с дестабилизированным QA, следует, по-видимому, ожидать, что (о-)фенантро-лин, полностью вытесняя QA, будет в значительной степени подавлять появление медленной фазы. С целью проверки этого предположения в настоящей работе проведено изучение влияния различных концентраций ингибиторов транспорта электронов-диурона и (о-)фенантролина на фото-индуцированное увеличение выхода флуоресценции у хлореллы.
МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовали аксеничную культуру одноклеточной зеленой водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick, термо-
фильный штамм БММБи Б-39 из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Культуру водоросли выращивали на 20% среде Тамия [12] в цилиндрических стеклянных культиваторах (250 мл) при освещении люминесцентными лампами с интенсивностью света 30 Вт/м2 на поверхности культиватора при 37°С и постоянной аэрации очищенным воздухом, необогащен-ным С02. Во время темновой инкубации суспензию клеток водоросли также аэрировали воздухом. Концентрация клеток в экспериментах не превышала 5 млн.кл./мл.
Интенсивность начального (темнового) уровня флуоресценции хлорофилла - измеряли с помощью импульсного флуориметра, освещая клетки слабой вспышкой света, которая вызывает срабатывание не более 3% РЦ ФС II, имеющихся в образце. Максимальную интенсивность флуоресценции - Ет при восстановленном первичном хинонном акцепторе - QA измеряли аналогичным образом, но при дополнительном освещении постоянным светом (7 Вт/м2) клеток хлореллы, обработанных 5 мкМ диурона.
Светоиндуцированное выделение кислорода целыми клетками водоросли измеряли с помощью электрода Кларка в закрытой термостати-руемой ячейке.
На рисунках показаны результаты характерных опытов, каждый из которых повторяли не менее пяти раз.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлены концентрационные зависимости влияния диурона или (о-)фенантроли-на на скорость фотоиндуцированного выделения кислорода целыми клетками хлореллы. Измерение скорости выделения кислорода проводили при интенсивности света (50 Вт/м2), насыщающей для фотосинтеза у клеток водоросли, выращенной на свету в стандартных условиях. Видно, что для подавления фотосинтетического транспорта электронов, измеренного по скорости фотоиндуцированного выделения кислорода, на 85-95% требуется 5 мкМ диурона или 1 мМ (о-)фенантро-лина. Длительная инкубация клеток хлореллы в темноте при 37°С практически не изменяла общий характер зависимости фотосинтетической активности от концентрации диурона или (о-)фе-нантролина.
На рис. 2 представлены индукционные кривые нарастания флуоресценции хлорофилла хлореллы, возбуждаемой периодическими вспышками слабого света. Видно, что само по себе добавление к клеткам 5 мкМ диурона, ингибирующего окисление QA , не вызывало изменения начального (темнового) уровня флуоресценции (Р0). Одна-
и
о
к н о
с«
и
о &
о ч о к м
к
о ч о и 3 я л н о
о &
о м
О
0.1 1 10 100 1000 Концентрация ингибитора, мкМ
Рис. 1. Зависимость скорости фотоиндуцированного выделения кислорода целыми клетками хлореллы от концентрации в пробе диурона (1) или (о-)фенантроли-на (2).
Интенсивность действующего света - 50 Вт/м2. Клетки выращивали на свету в оптимальных условиях.
ко дополнительное освещение постоянным светом (7 Вт/м2) таких обработанных диуроном клеток приводило к двухфазному увеличению выхода флуоресценции до максимального (Гт) уровня, обусловленному, очевидно [2], переходом РЦ ФС II в "закрытое" состояние с восстановленным первичным хинонным акцептором - QA. У клеток хлореллы, выращенных в оптимальных условиях на свету при 37°С (рис. 2а, кривая 1), в кинетике нарастания переменной флуоресценции-^ (где Г, = Гт - Г0) преобладала быстрая фаза - 6Fv со временем нарастания не более 1с. Медленная фаза - мГ, нарастания переменной флуоресценции (время нарастания - несколько минут) составляла не более 30-35%.
Длительная (24 ч) темновая инкубация при 37°С культуры хлореллы, предварительно выращенной в оптимальных условиях на свету, не оказывала существенного влияния на выход Гт у клеток, обработанных 5 мкМ диурона (рис. 2б, кривая 1). Однако у таких клеток значительно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.