ш
УДК 577.113.6
КОМПОЗИТЫ ПЕПТИДО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С НАНОЧАСТИЦАМИ ДИОКСИДА ТИТАНА. I. СОЗДАНИЕ НАНОКОМПОЗИТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ДНК/ПНК-ДУПЛЕКСЫ, И ДОСТАВКА ИХ В КЛЕТКИ HeLa © 2012 г. Н. В. Амирханов*, **, Р. Н. Амирханов*, **, В. Ф. Зарытова*, **, #
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8 **Новосибирский государственный университет Поступила в редакцию 10.02.2012 г. Принята к печати 12.05.2012 г.
С целью исследования возможности использования ТЮ2-наночастиц для транспортировки пепти-до-нуклеиновых кислот (ПНК) в эукариотические клетки был осуществлен синтез олигомера ПНК и разработан метод иммобилизации ПНК в виде гибридного ДНК/ПНК-дуплекса на ТЮ2-наноча-стицах, покрытых полилизином (РЬ), с образованием нанокомпозита TiO2 • PL • ДНК/ПНК. Связывание ДНК/ПНК-дуплекса с 1Ю2 • PL-наночастицами осуществлено за счет электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и положительно заряженными аминогруппами РЬ. Удерживание ПНК в составе нанокомпозита осуществлено за счет нековалентных Уотсон-Криковских взаимодействий между ПНК и комплементарной ДНК. Емкость полученных нанокомпозитов, в зависимости от условий иммобилизации, составляла 10—30 нмоль ПНК на 1мг частиц ТЮ2, что соответствовало ~1—3 молекулы ПНК на одну частицу ТЮ2 размером 5—6 нм. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии было показано, что флуоресцеин-меченные ПНК ( ПНК) в составе нанокомпозита ТЮ2 • PL • ДНК/Р'"ПНК способны без использования специальных трансфекционных агентов, электропорации или других вспомогательных процедур эффективно проникать в клетки НеЬа и удерживаться в них.
Ключевые слова: наночастицы; диоксид титана; пептидо-нуклеиновые кислоты, доставка в клетки; полилизин; конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
ВВЕДЕНИЕ
Пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК) являются аналогами нуклеиновых кислот (НК), в которых сохранены нуклеиновые основания, а саха-рофосфатный остов НК заменен псевдопептидной цепью, построенной из повторяющихся единиц Л-(2-аминоэтил)глицина [1]. ПНК, в отличие от ДНК или РНК, имеют незаряженный скелет, поэтому формируемые ими в физиологи-
Сокращения: AEEA — аминоэтоксиэтоксиацетил; Bhoc — бензгидрилоксикарбонил; DIEA — Л,Л-диизопропилэтил-амин; FBS — эмбриональная телячья сыворотка; FITC — флуоресцеинизотиоцианат; Flu — остаток флуоресцеина; Fmoc — 9-флуоренилметоксикарбонил; HATU — 2-(1H-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметил уронийгексафтор-фосфат; IMDM — модифицированная Исковым среда Дульбекко; Kd — равновесная константа диссоциации; NMM — Л-метилморфолин; PBS — калий-фосфатный буфер, содержащий 0.01 М KH2PO4, 0.14 М NaCl, рН 7.5; PL -полилизин; PS — полистирол, TBS — Трис-НС1-буфер, содержащий 0.01 М Трис-НС1, 0.14 М NaCl, рН 7.5. ПНК — пептидо-нуклеиновая кислота; ИиПНК — флуоресцеин-меченная ПНК. # Автор для связи: +7 (383) 363-51-23; факс: +7 (383) 363-51-53; эл. почта: zarytova@niboch.nsc.ru.
ческих условиях ПНК/ДНК- или ПН К/РНК-дуплексы более стабильны, по сравнению с аналогичными ДНК/ДНК- или ДНК/РНК-дуплексами [1—3]. ПНК устойчивы к действию нуклеаз и протеаз [4, 5]. Такие свойства ПНК делают их перспективными соединениями в качестве ген-направленных лекарственных препаратов. Однако сами по себе ПНК плохо проникают через клеточные мембраны [2, 6], и это одна из причин того, что они до сих пор не используются в медицине.
Для внедрения НК и их аналогов в клетки используют различные вирусные и невирусные способы доставки. Вирусные способы доставки, хотя и являются наиболее эффективными на сегодняшний день, однако обладают рядом недостатков, основной из которых это индуцирование вирусными векторами иммунного ответа той или иной силы (см. например, обзор [7]).
К невирусным способам относятся: доставка с помощью трансфекционных агентов, метод элек-тропорации или использование других вспомогательных процедур, способствующих проникновению НК через клеточные мембраны. Использова-
ние таких методов не всегда благоприятно влияет на жизнедеятельность клеток, поскольку при доставке могут образовываться эндосомные ком-партменты, внутри которых антисмысловая НК остается недоступной для своей мишени. В случае целого организма в некоторых случаях такие способы доставки не применимы в принципе (например, метод электропорации, или обработка клеток ионами Са+2). Существующие проблемы и методы доставки НК и их аналогов в клетки достаточно полно отражены в обзорах [2, 6—9].
В последнее время для решения проблем транспорта лекарственных средств в клетки начинают привлекать наноматериалы (см., например, обзоры [9—12]). Основными требованиями при их выборе для этих целей являются: безвредность для живого организма, способность проникать через клеточные мембраны и возможность обратимо присоединять лекарственные препараты. Сами наночастицы в этих случаях выполняют роль переносчика или транспортера лекарственного препарата.
Диоксид титана (TiO2) широко используется в медицине как биосовместимый материал. Нано-частицы TiO2 способны проникать через клеточные мембраны эукариотических клеток без привлечения каких-либо вспомогательных процедур [13, 14]. Структура поверхности наночастиц TiO2 позволяет проводить на них иммобилизацию различных органических соединений [15—20], в том числе, лекарственных препаратов [20]. Сами по себе молекулы диоксида титана не токсичны. Согласно сертификату FDA (управление по контролю за продуктами и лекарствами, США), в 1966 г. диоксид титана признан безопасным и безвредным для человека веществом. Соединения на основе диоксида титана широко используются в косметике и в качестве пищевых добавок. Более того, исследования последних лет показали, что наночастицы TiO2 в относительно низких дозах (вплоть до 200 мкг/мл) не проявляют какого-либо заметного замеряемого токсического эффекта и не оказывают вредного воздействия на клетки млекопитающих [21], на бактерии [22] и на животных [23]. Перечисленные свойства диоксида титана делают его потенциально привлекательным в качестве транспортера лекарственных препаратов, в том числе антисмысловых олигонук-леотидов и их ПНК-аналогов, в клетки млекопитающих.
Мы предположили, что транспорт ПНК в клетки можно осуществить путем создания нано-композитов, в состав которых будет входить ПНК и наноразмерные частицы диоксида титана, способные проникать в клетки.
Ранее доставляемые молекулы ПНК или ДНК присоединяли к 1Ю2-частицам ковалентно с ис-
пользованием допаминсодержащих ПНК- или ДНК-олигомеров [24, 25]. При этом, будучи прочно связанной с носителем, ПНК или ДНК, из-за стерических препятствий, создаваемых самим носителем, может оказаться мало доступной для взаимодействия с НК-мишенью внутри клетки. С этой точки зрения, привлекательной кажется идея фиксации целевой ПНК или ДНК на наноча-стицах в составе ДНК/ПНК- или ДНК/ДНК-дуплексов, прочность которых при конструировании может легко регулироваться длиной перекрывания комплементарных пар оснований в дуплексе. После доставки в клетки, ДНК/ПНК- или ДНК/ДНК-дуплексы при нарушении термодинамического равновесия в физиологических условиях могут распадаться, в результате чего ПНК или ДНК будут отделяться от 1Ю2-носителя и станут доступными для взаимодействия с НК-ми-шенью. Метод иммобилизации ДНК или ПНК на 1Ю2-частицах в виде комплементарных комплексов в литературе не описан.
Целью данной работы является создание на-нокомпозитов на основе наночастиц диоксида титана с иммобилизованными на них ПНК в виде гибридных ДНК/ПНК-дуплексов и исследование способности полученных нанокомпозитов проникать в клетки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Синтез ПНК
Синтез ПНК-олигомера (ПНК) проводили стандартным твердофазным методом с использованием Бтое-стратегии [1] согласно приведенной схеме 1, на пептидом синтезаторе Р83, который был приспособлен для синтеза пептидо-нуклеино-вых кислот [26, 27]. Структура синтезированного олигомера ПНК включала в себя 16-звенную произвольно выбранную последовательность ПНК, содержащую на N и С-концах цепи по две амино-этоксиэтоксиацетильные (АЕЕА) линкерные группы (схема 1). Введение АЕЕА-групп необходимо было для придания ПНК-олигомеру большей растворимости в воде. Средний выход присоединения одного мономерного звена, определяемый путем измерения количества удаляемых Бшое-групп на каждой стадии конденсации, составил 95.8%. Конечный выход олигомера ПНК после 20 шагов конденсации на тведофазном носителе составил 42.7%. Целевой продукт после удаления с полимерного носителя и деблокирования всех защитных групп очищали офВЭЖХ, собирая нужные фракции и анализируя их методом МАЬЭ1 ТОБ-масс спектроскопии.
HO
Fmoc-XAL-PEG-PS
O
■ 1
N^^O^COOH + H2N-Q
Fmoc' O
Fmoc-AEEA-OH
O и
HN
-o
h
BhocBhocBhocBhoc BhocBhocBhoc Bhoc BhocBhoc Bhoc Bhoc 1 1 1 1 Iii 1 1 1 1 1 H
[—(AEEA)2—C—A-A—C—T—C—C—A-T—A-T—G—C-C-A—T—(AEEA)2—
4
O H H O
H O
H
O
5
HH
V O^^N O С CAACTCCATATGCCAT 2
O
У=\ O-
\ /
II
O
II
O
HO
2
3
O
O
O
1. пиперидин/DMF (1 : 5).
2. а) НАГО, NMM, DMF; б) Ac2O/NMM/DMF; в) пиперидин/DMF (1 : 5).
3. Повторяющиеся циклы: a) Fmoc-AEEA-OH, Fmoc-T-OH, Fmoc-ABhoc-OH, Fmoc-GBhoc-OH или Fmoc-CBhoc-OH, HATU, NMM, DMF; б) Ac2O/NMM/DMF; г) пиперидин/DMF (1 : 5).
4. TFA/л-крезол.
5. FITC, DMSO/CH3CN/H2O, DIEA.
Схема 1. Твердофазный синтез олигомера ПНК (стадии 1—4) и его флуоресцентного производного FlunHK (стадия 5).
Структура модельных ДНК/ПНК и ДНК/ДНК дуплексов и их характеристики
Олигомер Структура дуплекса Длинна перекрывания п.о. т. пл., °C Дуплекс Kd (37°C), M
ПНК ДНК1 NC ААС ТССА TATGCCAT0 3TTTTTCTAGTTGAGGTAT5' 10 51.0 P1 7.6 x 10-8
ПНК ДНК2 nCAAC TCC A TA TG CC ATC 3'CTAGTTGAGGTATACGGTACAT5' 16 73.8 P2 3.2 x 10-13
ДНК3 ДНК1 5'CAACTCCATATGCCAT3' 3 'TTTTTCTAGTTGAGGTAT5' 10 34.3 Д1 4.0 x 10-6
ДНК3 ДНК2 5'CAACTCCATATGCCAT3' 3'CTAGTTGAGGTATACGGTACAT5' 16 57.9 Д2 8.5 x 10-11
Значения т. пл. получены при концентрации дуплексов 2 мкМ в PBS буфере. Ошибка измерений т. пл. составляет ± 1оС, для
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.